Pathogenesis and autoimmunity initiated by a viral protein-induced apoptotic bodies

Abstract

Ihmisen parvovirus B19 (B19) on laajalle levinnyt, yleinen virus, joka aiheuttaa lapsissa parvorokkoa (viides tauti). Aikuisille B19 aiheuttaa erinäisiä sairauksia, muun muassa nivelkipuja ja – tulehdusta, anemiaa, sekä raskaana oleville sikiöpöhöä. Lisäksi B19 infektio saattaa johtaa autoimmuunisairauksiin, kuten punahukkaan (systemic lupus erythematosus, SLE), nivelreumaan ja sydänlihastulehdukseen. Toisaalta infektio voi olla myös täysin oireeton. Mekanismit, jotka johtavat B19 tartunnasta autoimmuunisairauteen, ovat vielä tuntemattomia. Kuitenkin tiedetään, että B19:n ei-rakenteellinen proteiini NS1 on soluille tuhoisa ja aiheuttaa niiden kuoleman (apoptoosin) muodostaen solunjäännösten kanssa apoptoottisia kappaleita (ApoBodit). Nämä ApoBodit sisältävät itseantigeenejä sekä viruksen NS1 proteiinia. Tässä työssä tutkittiin B19 NS1 ApoBodien aiheuttamaa immuunireaktiota in vivo käyttäen hiiriä malliorganismina. Hypoteesina oli, että NS1 ApoBodit aiheuttavat hiirissä SLE:n kaltaisen autoimmuunireaktion, mikä ilmenee autovasta-aineiden tuottona, immuunisolujen tunkeutumisena kudoksiin sekä kudosvauriona. Hiiriin injektoitiin ApoBodeja kolmessa eri konsentraatiossa: 25 µg, 50 µg ja 100 µg. Hiiristä otettiin verinäytteet viikon päästä alkuperäisestä immunisaatiosta, ja viikolla neljä, ennen tehosteinjektion antamista. Kahdeksannella viikolla hiiret lopetettiin ja veri kerättiin seerumin eristystä varten. Aivot, sydän, munuaiset, maksa ja perna irrotettiin kudospatologista tutkimusta varten. Morfologisia ja patologisia muutoksia tarkasteltiin parafiiniin pedatuista, hematoksyliinilla ja eosiinilla värjätyistä kudosnäytteistä kirkaskenttämikroskopian avulla. Vasta-aineita kaksijuosteiselle DNA:lle (anti-dsDNA vasta-aineet) tutkittiin kaupallisella Crithidia luciliae immunofluoresenssitestillä, sekä tässä tutkimuksessa kehitetyllä entsyymivälitteisellä immunosorbenttimenetelmällä. Anti-dsDNA vasta-aineita, jotka ovat SLE:n biomarkkereita, havaittiin ApoBodeilla immunisoiduissa hiirissä molemmilla käytetyillä menetelmillä. Munuaisista, maksasta ja sydämestä löytyi immuunisolukeräytymiä. Lisäksi kaikkien hiirten aivoissa havaittiin neuronien rappeutumista, sekä demyelinaatiota kahdella suurimmalla ApoBodikonsentraatiolla. Samoilla hiirillä havaittiin myös sydänlihassolujen epäjärjestyneisyyttä, sekä sydänlihassolujen rappeumaa, joka oli nähtävissä jo alimmalla ApoBodikonsentraatiolla immunisoiduissa hiirissä. 50 µg:lla immunisoitujen hiirten pernassa oli muodostunut reaktiokeskuksia. Lisäksi valkoisen ytimen osuus hiirten pernasta kasvoi huomattavasti ApoBodikonsentraation myötä. Nämä löydökset tukevat hypoteesia. B19 NS1 ApoBodit tarjoavat elimistölle itseantigeenejä, johon immuunipuolustus reagoi ja näin ollen autoimmuniteetti saa alkunsa. Tämä tutkimus tarjoaa mekanismin B19 osallisuudesta autoimmuunisairauksien kehittymisessä. Lisäksi tässä tutkimuksessa kehitetty hiirimalli sekä mekanismi ovat sovellettavissa muiden patogeenisten virusten, kuten sytomegaloviruksen ja Epstein-Barr -viruksen tutkimiseen.

Human parvovirus B19 (B19) is a widespread virus that infects people of all ages. In children, it usually causes an erythema infectiosum, a rash illness called the Fifth disease. In adults, it can cause arthralgia, arthritis, different types of anemia, and hydrops fetalis in pregnant women. Furthermore, the infection can lead to severe autoimmune diseases such as systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, myocarditis, liver, and kidney diseases. However, the B19 infection can sometimes be asymptomatic. The exact mechanisms by which B19 contributes to autoimmune diseases are still not known. However, the non-structural protein 1 (NS1) of B19 is known as a cytotoxic protein that induces apoptosis in host cells, thus forming apoptotic bodies (ApoBods) that contain self-antigens along with viral NS1 protein. Mice were used as a model organism in this study to investigate the effects of the NS1 ApoBods in vivo. It was hypothesized that the ApoBods initiate an SLE-like autoimmune disease in mice which manifests itself as autoantibody production, immune cell infiltration into the tissues, and tissue damage. Mice were inoculated with 25 µg, 50 µg, and 100 µg of B19 NS1 induced ApoBods. Blood was collected from the mice at week one, and four, before booster injections were administrated. At week eight, the mice were euthanized, blood was collected and serum isolated. Brain, heart, kidneys, liver, and spleen were dissected from each mouse for histopathological analysis. Sections embedded in paraffin, and stained with hematoxylin and eosin were studied for morphological and pathological changes with bright-field microscopy. Presence of anti-double-stranded DNA antibodies was investigated with a commercial Crithidia luciliae immunofluorescence test, and with a newly developed enzyme-linked immunosorbent assay. Anti-double-stranded DNA antibodies, which are the signature biomarker of SLE, were detected with both methods in the mice inoculated with B19 NS1 ApoBods. Immune cell infiltrates were detected in the kidneys, heart, and liver of the mice. In addition, neuronal degeneration was detected in the brain of all the mice treated with B19 NS1 ApoBods, and suspected demyelination was seen in the brain of the mice treated with 50 µg, and 100 µg of B19 NS1 ApoBods. Myocardial disarray was observed in the hearts of these two groups. Furthermore, in the hearts of all mice treated with B19 NS1 ApoBods, myocardial degeneration was detected. In the spleen of mice treated with 50 µg of the ApoBods, germinal centers had formed. Moreover, the proportion of the white pulp in the spleen was significantly increased by the dosage of ApoBods. These findings supported the hypothesis. B19 NS1 ApoBods cause inflammation by providing self-antigens to which the immune system reacts, and autoimmunity is initiated. Hence, this study provided a mechanism of B19 involvement in the pathogenesis of autoimmune diseases. Furthermore, this mechanism and model are applicable to studies of other viruses, such as cytomegalovirus and Epstein-Barr.