T cell differentiation by human parvovirus B19 non-structural protein 1 induced apoptotic bodies

Abstract

Uutta tietoa ihmisen immuunijärjestelmästä ja sen toiminnasta kerätään jatkuvasti. Synnynnäinen ja hankittu immunijärjestelmä toimivat yhteistyössä erilaisia patogeeneja vastaan. Dendriittisolut toimivat siltana synnynnäisen ja hankitun vastustuskyvyn välillä stimuloimalla T ja B lymfosyyttejä. Antigeenin esittely luokan II MHC molekyylin (eng. major histocompatibility complex) ja T solun reseptorin (TCR) välillä, sekä erillisen reseptorin ja ligandin tai sytokiini -signaalin välityksellä, CD4+ T solut stimuloituvat ja erilaistuvat. Erilaistuneita CD4+ T auttajasoluja (Th, eng. T helper cell) on eri alalajeja, jotka osallistuvat vaihtelevasti immuunipuolustukseen, esimerkiksi suojana erilaisia viruksia vastaan. Ihmisen parvovirus B19 (B19V) infektoi niin lapsia kuin aikuisiakin. Tartunta voi olla oireeton tai oireet voivat vaihdella flunssankaltaisesta vakavampiin tauteihin kuten parvorokkoon, nivelsairauksiin ja sikiön vesipöhöön. B19V on myös yhdistetty autoimmuunisairauksiin kuten nivelreumaan ja perhosreumaan (lupus). Patogeenisyyden mekanismeja B19V:een liittyvissä autoimmuunisairauksissa ei ole kuitenkaan vielä selvitetty. Kuitenkin tiedetään, että viruksen ei-rakenteellinen proteiini 1 (NS1) aiheuttaa isäntäsolussa tuhoa ja jopa apoptoosia. NS1 proteiinin kykyä laukaista immuunireaktio tarkkailtiin tässä työssä. Tutkimuksen tavoitteena oli kartoittaa T solujen ja dendriittisolujen kanssakäymistä B19V NS1 proteiinin aiheuttamien apoptoottisilla kappaleilla (ApoBodit) stimuloinnin jälkeen. Hypoteesina oletettiin, että NS1:n synnyttämät ApoBodit saavat aikaan immuunireaktion, jossa erityisesti autoimmuniteettiin viittaavat Th1 ja Th17 solut erilaistuvat. Seitsenpäiväinen kypsymisprotokolla perustettiin kaupalliselle dendriittisolulinjalle (MUTZ-3, sytokiini- riippuvainen ihmisen solulinja) ja kypsyminen viimeisteltiin 48 h kestävällä stimuloinnilla. Tämän jälkeen stimuloituja MUTZ-3 soluja kasvatettiin yhdessä T solujen kanssa 24 h, 72 h, ja 7 pv:n ajan. Virtaussytometriaa ja konfokaalimikroskopiaa käytettiin solunulkoisten merkkien tutkimiseen niin kypsytetyiltä MUTZ-3 soluilta kuin yhteiskasvatetuilta T soluilta kolmesta eri aikapisteestä. CD83 toimi kypsien dendriittisolujen solunulkoisena leimana, kun taas kuutta erilaista T solujen alalajien merkkiä käytettiin T solujen värjäyksessä: CD8a, CD4, CD183 Th1 soluille, CD194 Th2 soluille, CD196 Th17 soluille ja CD25 T säätelijäsoluille (Treg, eng. T regulatory cell). Myös sytokiinituotantoa tutkittiin 24 h ja 72 h aikapisteiltä. Dendriittisolujen kypsymistulokset osoittivat >10 % kypsymistä. Tämän lisäksi yhteiskasvatetut T solut osoittivat erilaistumista kaikista tutkituista T alalajityypeistä, vaikkakin Th2 soluja oli erilaistunut enemmän kuin muita alalajeja (Th1, Th17 ja Treg) 72 h aikapisteestä eteenpäin. 7 pv:ään mennessä Th1 ja Th17 solut olivat tasaisesti kasvaneet 2.5 % ja 1.5 % vastaavasti, kun taas Th2 ja Treg solut lisääntyivät 72 h aikapisteeseen asti mutta hupenivat 7 pv:n mennessä. Näiden lisäksi sytokiinianalyysi ilmensi tulehdusta edistävien ja hillitsevien sytokiinien tuotannon. Kuitenkaan kullekin T solujen alalajille tyypillisiä sytokiinejä ei tutkimuksessa havaittu. Tutkimuksen tuloksena voitiin kuitenkin todeta, että NS1 indusoimat ApoBodit stimuloivat tulehdusreaktion, jossa erilaistui variaatio T solujen alalajeja. Tämän lisäksi hypoteesi todettiin paikkansa pitäväksi, sillä Th1 ja Th17 soluja oli erilaistunut ja solujen määrä kasvanut kokeen eri aikapisteiden välillä. NS1 proteiinin aiheuttamia immuunireaktioita on kuitenkin tutkittava lisää, jotta B19V:een liittyvien autoimmuunisairauksien syntymisen mekanismit voidaan tunnistaa.

New information about the human immune system and its functions is constantly being gathered. The innate and adaptive immunities work in coherence against various pathogens. Dendritic cells (DCs) bridge the gap between the innate and adaptive immune systems by stimulating T and B lymphocytes. Antigen presentation between class II major histocompatibility complex (MHC II) and a T cell receptor, with an additional co-stimulation through receptor-ligand interaction or by a cytokine signal, stimulates CD4+ T cells to differentiate. A variety of differentiated CD4+ T helper (Th) cells are known to participate differently in diverse immune responses such as protection against viruses. For instance, human parvovirus B19 (B19V) infects children and adults alike. The symptoms vary from none to flu-like symptoms to more serious diseases such as erythema infectiosum (fifth disease), arthropathy and hydrops fetalis. Furthermore, B19V has been implicated in autoimmune diseases like rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus. However, the exact mechanism of pathogenicity is yet unknown. Nonetheless, the non- structural protein 1 (NS1) is known to cause cell damage and even apoptosis in the host. Hence, examining the capability of NS1 to trigger an immune response was studied. The aim of this study was to investigate DC and T cell interaction after the stimulation with B19 NS1 induced Apoptotic Bodies (ApoBods). The hypothesis was that NS1 induced ApoBods stimulate an immune reaction in vitro, in which the autoimmune related Th1 and Th17 cells are differentiated. A seven-day maturation period for the commercial dendritic cells (MUTZ-3, the cytokine-dependent human cell line) was set up, and the maturation was finalized with a 48 h stimulation period with NS1 induced ApoBods. Afterwards, stimulated MUTZ-3 cells were co-cultured with T cells for 24 h, 72 h and 7 d. Flow cytometry and confocal microscopy were used to examine the extracellular markers on both the mature MUTZ-3 cells and the co-cultured T cells from each of the three time points. CD83 was the extracellular marker for mature DC detection, while six different T cell subtype markers were used for T cell labeling: CD8a, CD4, and CD183 for Th1, CD194 for Th2, CD196 for Th17, and CD25 for T regulatory (Treg) cells. Additionally, the supernatants from the 24 h and 72 h time points were studied for cytokine production. The results of the DC maturation experiment illustrated >10 % maturation of dendritic cells. Moreover, the co-cultured T cells demonstrated differentiation of each T cell subtype examined. The formation of differentiated Th2 cells after 72 h was at a higher quantity than the other CD4+ T cell subtypes (Th1, Th17, and Treg). At day 7, the Th1 and Th17 cells had steadily increased to 2.5 % and 1.5 %, respectively. Although Th2 and Treg cells had first increased at 72 h time point, both had decreased at 7 d. Furthermore, the cytokine analysis exemplified the production of pro- and anti- inflammatory cytokines. However, no signature cytokines for each T cell subtype were discovered. Still, it can be noted that NS1 induced ApoBods stimulated an inflammatory immune reaction, where a variety of T cell subtypes were formed. Moreover, the hypothesis was proven accurate, as Th1 and Th17 cells had differentiated, and the number of cells had increased throughout the experimented time points. Still, further studies on NS1 induced immune reactions are required to identify the exact mechanisms of initiation for B19V –related autoimmunity.