Filamiinin ja pernan tyrosiinikinaasin sitoutuminen sekä vuorovaikutuksen merkitys verihiutaleiden signaloinnissa

Abstract

Hyytymän muodostuminen tapahtuu verisuoneen kohdistuneen vaurion seurauksena verenvuodon tyrehdyttämiseksi. Hyytymä voi muodostua myös verisuonen pinnalle silloinkin kun verenvuotoa ei esiinny. Irrotessaan verenvuodon mukaan hyytymä voi olla hengenvaarallinen. Erilaiset hyytymän muodostamat veritulpat ovat merkittävä kuolinsyy vuosittain. Verihiutaleet ovat keskeinen tekijä tässä tapahtumassa. Niiden aktivaatio tapahtuu kalvoreseptoreiden ja solun sisäisen signaloinnin monimutkaisesta vuorovaikutuksesta. Tämän tutkimuksen kohteina ovat pernan tyrosiinikinaasi ja filamiini A, joiden välinen vuorovaikutus on tärkeää verihiutaleiden toiminnalle. Verihiutaleet, joissa tämä vuorovaikutus on häiriintynyt, ovat morfologisesti epänormaaleja eivätkä toimi normaalilla tavalla hyytymän muodostumisessa. Pernan tyrosiinikinaasi, Syk (engl. spleen tyrosine kinase) on ei-reseptorityyppinen solun signalointiin liittyvä proteiinikinaasi. Se esiintyy solussa sekä solulimassa että tumassa. Syk on osallisena monissa solun fysiologisissa tapahtumissa, esimerkiksi morfogeneesissä, solun kasvussa, migraatiossa ja solun tukirangan uudelleen järjestäytymisessä. Filamiini on kookas solutukirangan proteiini. Filamiinin tiedetään vuorovaikuttavan useiden muiden proteiinien kanssa monissa eri rooleissa. Se liittää solussa aktiinisäikeitä verkostoksi, se ankkuroi kalvoproteiineja solun tukirankaan ja toimii solussa sekä signaalivälitysproteiinien telineenä että mekaanisena tukena. Tässä työssä tutkittiin filamiini A:n ja Syk:n sitoutumista ja sen affiniteettia. Erityisenä kysymyksenä oli selvittää, vaikuttaako filamiinin neljännen immunoglobuliinin kaltaisen domeenin läheinen vuorovaikutus viidennen domeenin kanssa Syk:n sitoutumiseen viidenteen domeeniin. Alustavissa kokeissa havaittiin Syk:n sitoutuminen viidenteen domeeniin eikä neljännellä domeenilla havaittu olevan vaikutusta sitoutumiseen. Hankaluudet Syk:n tuottamisessa E.coli-bakteerisoluissa rajoittivat tutkimusta. Kun Syk:n tuotto-ongelmat saadaan ratkaistua, voidaan suorittaa jatkotutkimuksia sitoutumisen mekanismista.

Platelet thrombi are essential to stop bleeding. While thrombi are formed occasionally without the need to stop bleeding, a loose clot in the circulation may cause morbidity and mortality. Activation of platelets is a complicated process including an interplay of cell surface receptors and intracellular signalling networks. Spleen tyrosine kinase and the acting binding protein filamin are a part of this process. Spleen tyrosine kinase (Syk) is a cytosolic non-receptor tyrosine kinase, which is highly expressed in haematopoietic cells. Syk is known to have a crucial role in signalling. It plays some role in cellular functions like morphogenesis, cell growth, migration and cytoskeletal reorganization. Filamin is part of a family of three proteins that are products of distinct genes. They are large actin cross-linking proteins, but they are also known to interact with a wide variety of binding partners. Filamin serves as an integrator of cell mechanics and signalling. The aim of the study was to confirm the binding between filamin and Syk and to determine the affinity of the binding. The special interest was to observe whether the filamin domain 4 has an effect on binding between filamin domain 5 and Syk, because a structure analysis has revealed that there is a novel type of domain-domain interaction in the structure of domain pair 4-5. Initial binding assay studies indicated a binding between filamin domain 5 and Syk. Filamin domain 4 had no apparent effect on the binding. For future studies it is at first necessary to resolve the challenges with the expression and purification of Syk.