The effects of photosensory module components for phytochrome activity and spectroscopy

Abstract

Bakteerifytokromit voivat säädellä isäntäsolun sisäistä metaboliaa valo-olosuhteista riippuen. Tämän mahdollistaa se, että fytokromit voivat toimia osana kaksikomponenttijärjestelmiä, jotka voivat puolestaan säädellä geenien ilmentämistä soluissa. Yhdistettäessä fytokromien valoa aistivat ominaisuudet ja kaksikomponenttijärjestelmien säätelyominaisuudet on mahdollista kehittää optogeneettisiä sovelluksia lääketieteellisistä hoidoista aina biomateriaalien tuotantoon. pREDusk on optogeneettinen työkalu, jota voidaan käyttää Escherichia coli bakteerissa punaista fluoresoivan reportteriproteiinin geenin ilmentämisen säätelyyn. pREDuskin valoa aistiva osa on kanonisen Deinococcus radiodurans bakteerifytokromin valoa aistiva moduuli, jota voidaan kontrolloida punaisen ja kaukopunaisen valon avulla. Tämä pro gradu tutkielma keskittyy pREDusk työkalun toiminnallisuuden muuttamiseen. Tällä hetkellä punainen valo vaimentaa geenin ilmentämistä ja tutkimuksen tarkoituksena oli sen sijaan aktivoida geenin ilmentäminen kaukopunaisen valon avulla. Muutosta yritettiin hyödyntämällä kahden eri bathyfytokromin valoa aistivaa moduulia, sillä nämä fytokromit reagoivat kaukopunaiseen valoon punaisen valon sijasta. Vaihdokset sisälsivät kaksi koko valoa aistivan moduulin vaihdosta sekä kaksi varianttia, joissa vain ARM-osa valoa aistivasta moduulista vaihdettiin. Tutkimus toteutettiin puhdistamalla muunnellut proteiinit ja tutkimalla niiden entsymaattista aktiivisuutta. Lisäksi varianttien spektroskopisia ominaisuuksia tarkasteltiin UV-Vis ja FTIR spektroskopioiden avulla. Lopuksi pREDusk varianttien geenin ilmentämistä tutkittiin in vivo. Työn tuloksena kolme neljästä proteiinivariantista saatiin puhdistettua. Variantit, joiden ARM osa oli vaihdettu, olivat valosykliltään kanonisia, mutta kun koko valoa aistiva osa vaihdettiin, oli fotosykli käänteinen ja täten bathyfytokromeille tyypillinen. Variantit, joissa vain ARM-osa oli vaihdettu toimivat kuten alkuperäinen työkalu. Puolestaan variantteja, joiden koko valoa aistiva osa oli vaihdettu, ei muutosten jälkeen voitu enää säädellä valolla. Huomionarvoista on, että kaikki puhdistetut proteiinit vaihtuivat kahden valosta aktivoituvan tilan välillä, mikä tarkoitti, että vaihdokset olivat onnistuneita vaikkakaan niiden avulla ei saatu muutettua pREDuskia valolla aktivoitavaksi. Työn löydösten perusteella voidaan pREDusk työkalun kehittämiseksi tulevaisuudessa kokeilla uudenlaisia muutoksia.

Bacterial phytochromes can regulate the metabolism of species in response to light conditions. This is achieved through their involvement in two-component systems that can control gene transcription. The light controllability of phytochromes and their regulatory properties through two-component systems offer numerous applications in optogenetics, ranging from medical treatments to bio-material production. pREDusk is an optogenetic tool used in Escherichia coli to control the transcription of a red-fluorescent reporter gene. The light-sensing part of the tool is the photosensory module (PSM) of the prototypical bacteriophytochrome of Deinococcus radiodurans, and thus pREDusk can be controlled with red and far-red light. This master’s thesis project is focused on tuning the functionality of pREDusk. Currently, red light attenuates gene transcription, and the aim was to achieve upregulation of gene transcription in response to far-red light instead. This was tried by modifying the photosensory part of pREDusk by using PSMs from two bathy phytochromes with an inverted photocycle. These replacements included switching the whole PSM and only switching a specific part of the PSM known as an ARM. During this master’s thesis project, the modified proteins were purified, and their enzymatic activity was studied. The spectroscopic properties were observed with UV-Vis and FTIR spectroscopy, and the modified pREDusk was studied in vivo. As a result, three out of the four protein variants were purified. The purified variants, in which only the ARM part was replaced, were prototypical, and when the entire PSM was replaced, the photocycle was bathy. Regarding gene expression controlled by pREDusk, variants with ARM replacements expressed the fluorescent marker in darkness and under far-red light, indicating no change in the activation pattern. With the whole PSM replaced variants the controllability was lost. Notably, all the purified proteins converted between two states, in response to light, which meant that the replacements were successful in this sense even though pREDusk could not be turned light activatable. Based on the findings of this study, there is a solid foundation for implementing further replacements to improve pREDusk.