Designing and testing red light-activated optogenetic tool for controlling gene expression in mammalian cells

Abstract

Optogenetiikka tutkii ja ohjaa soluja valoherkkien proteiinien, valoreseptorien avulla. Eräs valoreseptorityyppi on bakteerifytokromit, jotka aistivat punaista ja kaukopunaista valoa. Luonnossa bakteerifytokromit ovat usein valoherkkiä histidiinikinaaseja (HK) ja toimivat osana kaksikomponenttijärjestelmää, jonka avulla bakteerit aistivat ympäristön signaaleja ja säätelevät soluvasteita, kuten geeniekspressiota. Tämäntyyppisiä valoreseptoreja ja signalointireittejä voidaan hyödyntää optogenetiikassa säätelemällä niiden avulla geeniekspressiota kohdeorganismin soluissa. Tässä Pro Gradu -työssä tuotettiin uusi, punaisella valolla aktivoituva optogeneettinen työkalu, mDERusk, geeniexpression ohjaamiseen nisäkässoluissa. mDERusk hyödyntää bakteerifytokromin valoa aistivaa osaa kimeerisessä HK komponentissa osana kaksikomponenttijärjestelmää, jolla säädellään kohdegeenin transkriptiota. Työkalu valmistettin kääntämällä olemassa olevan nisäkässolujen geeniekpressiota ohjaavaan optogeneettisen mREDusk työkalun toiminta pimeässä aktiivisesta punaisen valon avulla aktivoitavaksi, jotta saavutetaan tarkempi spatio-temporaalinen ohjailtavuus. Aktiivisuuden kääntyminen saatiin aikaan muokkaamalla valoa aistivan osan ja HKn välistä linkkerialuetta niin, että kimeerisen HKn kinaasiaktiivisuus ja valovaste muuttuivat käänteisiksi. Mutatoitu työkalu kloonattiin Gibson assembly -menetelmällä ja tuotettiin Escherichia coli -bakteereissa. Työkalun toimintaa tutkittiin HEK293 -soluissa kvantifioimalla luminesoivan reportterigeenin ilmentyminen indusoivan punaisen valon alla ja pimeässä inkuboiduissa soluissa, joissa ilmentyminen inhiboituu. Luminesenssimittauksen tulokset osoittivat, että valosta riippuvaisen kinaasiaktiivisuuden kääntäminen onnistui ja punaisen valon alla havaittiin korkeampi reportteriproteiinin tuottuminen. Optimoimalla työkalun toimintaa edelleen, tämän tyyppisiä työkaluja voidaan käyttää esimerkiksi uuden tyyppisten biolääketieteellisten sovellusten kehittämiseen.

Optogenetics studies and control living cells with light-sensitive proteins, photoreceptors. One photoreceptor class is the red and far-red light-sensing bacterial phytochromes (BphPs). In nature, BphPs are often light-sensitive histidine kinases (HKs) that are part of a two-component system (TCS). TCS is common signalling pathway that bacteria use to sense environmental cues and transduce the signals into cellular responses, such as gene expression. For optogenetic purposes, these types of photoreceptors and signalling pathways can be used to build optogenetic circuits to control events in different types of cells in the host organism. Here a novel, red light-activated optogenetic tool, mDERusk, was created for controlling gene expression in mammalian cells. mDERusk utilises photosensory module of BphP in chimaeric light-sensitive HK component of TCS to regulate target gene transcription. The strategy to construct mDERusk was to invert the light response of an existing optogenetic tool mREDusk from dark to red light activated for improved spatio-temporal regulation over the expression. The inversion was done with a modification to the linker region between the BphP photosensory and HK effector modules, which inverts the light-dependent kinase activity and the photoresponse of the chimaeric HK component. The mutated tool was cloned with the Gibson assembly method and produced in Escherichia coli -bacteria. The function of mDERusk was studied in HEK293 cells by quantifying the expression of luminescent reporter gene in inducing red light or inhibiting dark conditions. Luminescence assays showed successful inversion of the light-dependent kinase activity and upregulation of reporter protein expression with red light. With further optimization, these types of red light-sensitive optogenetic tools could be used e.g. in developing novel biomedical applications.