PKR phosphorylation as an Indicator for echovirus 1 genome egress from endosomes

Abstract

Isäntäsolut ovat kehittäneet useita keinoja tunnistaa viruksia ja estää niiden lisääntyminen. Yksi näistä keinoista on translaatioon vaadittavan tukiproteiini eukaryotic intiation factor 2:n (eIF2) fosforylaatio, joka estää translaation tehokkaasti. Kaksijuosteisesta RNA:a (dsRNA) aktivoituva protein kinase dsRNA-dependent-proteiini (PKR) on eIF2 kinaasi, joka itsefosforyloituu aktivoituessaan. Sekä PKR:N että eIF2:n fosforylaatio yhdistetään usein antiviraaliseen soluviestintään. Echovirus 1 (EV1) kuuluu enterovirusten B-alaryhmään, jonka jäsenistä useat on yhdistetty tyypin 1 diabeteksen puhkeamiseen sille altistuneissa lapsissa. Se tunkeutuu isäntäsoluihin endosominkaltaisissa rakkuloissa ja vapauttaa genominsa proteiinikuoresta näissä rakkuloissa. Ei ole täysin varmaa miten EV1 genomi pääsee rakkulakalvon läpi solulimaan, jossa translaatio ja replikaatio tapahtuvat. Tässä työssä osoitamme, että EV1-infektoituihin soluihin transfektoidut virusgenomille komplementaariset oligonukleotidikoettimet aktivoivat PKR:n fosforylaatiota muodostaessaan kompleksin virusgenomin kanssa solulimassa. Tätä fosforylaatiota voi käyttää osoittamaan, että EV1 genomi on vapautunut endosomirakkulasta solulimaan, mikä tapahtui A549 soluissa noin 2,5−3,5 tuntia infektion jälkeen. Pidemmälle kehitettynä tämä uusi metodi voi tulevaisuudessa auttaa selvittämään, miten EV1:n genomi vapautuu endosomista, löytämään siihen liittyviä proteiineja sekä kehittämään lääkkeitä ja rokotteita EV1:ä vastaan.

Pathogens may trigger various antiviral responses in eukaryotic cells. One such response is preventing viral translation by eukaryotic initiation factor 2 (eIF2) phosphorylation. Protein kinase double-stranded RNA-dependent (PKR) is an eIF2 kinase activated by phosphorylation after exposure to double-stranded RNA (dsRNA). Though they act as hub elements for several stress signalling pathways, PKR and eIF2 phosphorylation is strongly associated with antiviral responses. Echovirus 1 (EV1) belongs to the enterovirus subgroup B, many members of which have been implicated in the development of type 1 diabetes in individuals exposed to the virus as infants, sparking interest in their biology and the development of drugs and vaccines. The major entry route of EV1 is via endosomal-like vesicles in which the uncoating of the genome occurs. How and when echoviral genomes cross this membrane barrier to the cytoplasm is not well known. Here we demonstrate that the phosphorylation of PKR can be induced by dsRNA composed of released EV1 genomes and transfected oligonucleotide probes. Furthermore, this phosphorylation can be detected by Western blot and used to demonstrate that echovirus 1 genomes cross the endosomal membrane barrier approximately 2.5−3.5 hours post-infection in A549 cells. If developed further, this new method may help characterise the mechanism of endosomal egress and any proteins involved as well as provide a tool for anti-echoviral drug and vaccine development.