Regulation of raft-derived endocytic pathways : studies on echovirus 1 and baculovirus

Abstract

Elina Kakkonen tutki väitöskirjassaan kahden erilaisen viruksen, echovirus 1:n ja bakuloviruksen soluun sisäänmenon reittejä ja säätelijöitä. Echovirus 1 (EV1) on ihmisiä infektoiva pikornavirus, joka voi aiheuttaa esimerkiksi aivokalvontulehdusta, sydänlihastulehdusta sekä lievempiä hengitystieinfektioita. Bakulovirus puolestaan on ihmisille vaaraton, hyönteisiä infektoiva virus, joka on osoittautunut lupaavaksi geeninsiirtokuljettajaksi geeniterapiassa.Virukset voivat käyttää soluun tunkeutumisessaan hyväkseen soluissa valmiina olevia erilaisia reittejä, joita solut itse tarvitsevat esimerkiksi ravintoaineiden sisäänottoon. Näin virukset pääsevät solun sisälle solun oman koneiston kuljettamina, siis eräänlaisina vapaamatkustajina. Sekä echovirus 1:n että bakuloviruksen huomattiin käyttävän samankaltaisia reittejä soluun tunkeutumisessaan. Echovirus 1:n kohdalla reitiksi osoittautui makropinosytoosi, ja bakulovirus puolestaan käytti fagosytoosin kaltaista reittiä.- Tulokset olivat erittäin mielenkiintoisia ja yllättäviäkin, sillä näiden kahden reitin ei ole todettu olevan kovinkaan monen viruksen ensisijaisia sisäänmenoreittejä. Lisäksi makropinosytoosin tärkeäksi säätelytekijäksi löysimme proteiinin, jota ei ole aikaisemmin karakterisoitu kyseiselle reitille, Kakkonen kertoo.EV1:n sekä sen reseptorin, α2β1-integriinin, todettiin päätyvän solun sisällä uudenlaisiin rakenteisiin (α2-MVB), jotka eroavat toiminnaltaan ja rakenteeltaan muista solunsisäisistä rakenteista. Lisäksi EV1 ja α2β1-integriini olivat riippuvaisia solukalvon ehjistä kolesterolidomeeneista soluun tunkeutumisessaan. Myös EV1:n kyky infektoida soluja oli riippuvaista ehjistä, kolesterolia sisältävistä α2-MVB-rakenteista, sillä kolesterolin aggregoiminen eli yhteen kokoaminen rakenteiden pinnalla esti virusinfektion tehokkaasti.- Solukalvolla kolesteroli ja sfingolipidit voivat muodostaa hyvin järjestäytyneitä, lateraalisia alueita, ns. lipidilauttoja, joiden merkitystä virusten elinkierron aikana tutkitaan kiivaasti. EV1:n todettiin tarvitsevan kolesterolia ja siten mahdollisesti myös lipidilauttoja sekä soluun tunkeutumisen että viruksen genomin vapautumisen aikana. Myös bakuloviruksen tunkeutuminen soluun alkoi solukalvon kolesterolirikkailta alueilta. Nämä tulokset antavat arvokasta lisätietoa kolesterolin ja lipidilauttojen osallisuudesta virusinfektion etenemisessä, Kakkonen toteaa.Virusten kulkureitit solun sisään on ensin tunnettava, jotta virusten aiheuttamia tauteja voitaisiin estää tai hoitaa. Tulokset auttavat lisäämään ymmärrystämme virusten ja niiden isäntäsolujen monimutkaisista vuorovaikutussuhteista. Lisäksi bakuloviruksen soluun sisäänmenoreitin tunteminen edistää bakulovirusperäisten kuljettimien kehittämistä geeniterapian tarpeisiin

To efficiently enter cells, viruses utilize different endocytic pathways. In this thesis, the regulators and entry routes utilized by a human pathogen, echovirus 1 (EV1), as well as an insect pathogen and potential gene therapy vector, baculovirus Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus, were studied. EV1 was shown to enter cells with fluid-phase markers in tubulovesicular structures that matured into multivesicular bodies. The pathway was regulated by factors that have been associated generally with macropinocytosis, namely phospholipase C, phosphatidylinositol 3-kinase, Rac1 and p21-activated kinase-1. C-terminal binding protein1/brefeldin A-ADP ribosylated substrate (CtBP1/BARS) was shown to be a novel regulator of epidermal growth factor-induced macropinocytosis, and CtBP1/BARS also had an essential role in the entry of EV1 and α2β1 integrin, the receptor of EV1. EV1 and α2β1 integrin originated from lipid raft-derived plasma membrane areas, and the internalization was dependent on cholesterol both at the plasma membrane and during the later stages of entry. The multivesicular structures formed after α2β1 integrin clustering (α2-MVBs) were sensitive to cholesterol-aggregating drugs, but not to Triton X-100 treatment, indicating that they were enriched in cholesterol and possibly raft lipids. Cholesterol-aggregating drugs also inhibited EV1 uncoating and had a great impact in the cytoplasmic α2-MVB structures.Baculovirus internalization into mammalian cells was sensitive to a cholesterol-aggregating drug, and the internalization induced membrane ruffling. The virus entered cells together with fluid-phase markers in large, noncoated vesicles. Regulators of the clathrin-mediated pathway or macropinocytosis were not involved in baculovirus entry. Instead, the pathway was regulated by RhoA and Arf6, and the virus triggered the uptake of phagocytic marker E.coli into non-phagocytic human cells. These results suggest that baculovirus entry occurs via a mechanism that is reminiscent of phagocytosis