Solusyklin G2/M-vaiheen säätelyn vaikutus koiran parvoviruksen tumasta vapautumiseen

Abstract

Koiran parvovirus (engl. canine parvovirus, CPV) on pieni (halkaisijaltaan ~25 nm), vaipaton protoparvovirus. Sillä on ikosahedraalinen kapsidi joka ympäröi noin 5 kb pitkää, yksijuosteista DNA -genomia. CPV kulkeutuu solun sisään klatriinivälitteellä endosytoosilla. Vapauduttuaan endosomeista se kuljetetaan tumaan, jossa genomi replikoidaan ja pakataan uusiin kapsideihin. Lopulta valmiit virukset maturoituvat ja poistuvat tumasta infektoidakseen uusia soluja. Parvovirusten on havaittu tarvitsevan isäntäsolunsa solusyklin säätelyä edistääkseen genominsa replikaatiota tai uusien partikkeleiden kasaamista. Parvovirusinfektion seurauksena solusykli pysähtyy S/G2-vaiheeseen. On toistaiseksi epäselvää tarvitsevatko parvovirukset solusyklin säätelyä myös vapautuakseen isäntäsolunsa tumasta. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää CPV:n tumasta vapautumiseen johtavia muutoksia solusyklissä ja tumadynamiikassa. Parvoviruksen tumasta vapautumisen tiedettiin ajoittuvan S/G2-vaiheen loppuun, joten solusyklin etenemistä kohti M-vaihetta tarkasteltiin kyseiselle siirtymälle keskeisen säätelyproteiinin, sykliini B1:n avulla. Aikaisemmissa tutkimuksissa CPV:n on havaittu aiheuttavan katkoksia isäntäsolujensa tumakuljetukseen myöhäisessä vaiheessa infektiota. Tässä tutkimuksessa pyrittiin selvittämään liittyvätkö nämä ilmiöt viruksen tumasta poistumiseen ja G2/M -siirtymään. Tutkimus osoitti ensimmäistä kertaa, että CPV:n tumasta poistuminen ajoittuu G2/M –vaiheeseen. Tutkimuksessa havaittiin, että myöhäisen vaiheen CPV-infektio aiheuttaa erityisesti importiini β:n sekä sykliini B1:n, mutta myös sykliini B1:n fosforyloitujen muotojen akkumuloitumista tumaan. Virusten marginalisoituessa tumakotelon sisäpinnalle ennen tumasta poistumistaan, sytoplasmista sykliini B1:tä fosforyloitiin seriineistä 126 ja 147, jonka seurauksena molemmat fosforylaatiot akkumuloituivat samanaikaisesti tumaan. Nopea tuma-akkumulaatio osoittaa solusyklin edenneen G2/M-vaiheeseen. Lisäksi S126 ja S147 fosforyoitujen sykliinien määrän todettiin kasvavan infektion edetessä. Nämä tulokset kertoivat solun vähitellen siirtyvän G2/M-tarkastuspisteeseen infektion aikana. Tutkimuksessa havaittiin lisäksi, että viruksen poistuessa tumasta sytoplasmaan, S147 fosforyloitu sykliini B1 akkumuloitui tuman sijasta sytoplasmaan, mikä kertoo sykliini välitteisestä G2/M –säätelystä viruksen tumasta poistumisen aikana. Tutkimuksen perusteella on kiistatonta, että myös myöhäinen infektio vaikuttaa solusyklin etenemiseen ja G2/M-vaihe on keskeistä viruksen tumasta poistumiselle. Lisätutkimuksia kuitenkin tarvitaan näihin G2/M -vaihetta edistävien signalointireittien selvittämiseksi. Erityisesti infektion seurauksena aktivoituvan DNA-vauriovasteen merkitys havaitulle G2/M-siirtymälle on tärkeä tulevaisuuden tutkimuskohde.

Canine parvovirus (CPV) is a small (~25 nm in diameter) nonenveloped protoparvovirus. An icosahedral capsid encloses a single stranded DNA genome of ~5 kb in length. CPV internalisation into a host cell occurs via endocytosis followed by transport into the nucleus. Viral genome is replicated and packaged into newly assembled capsids in the nucleoplasm. Following maturation progeny viruses egress from the nucleus and are ready to infect other cells. Parvoviruses are dependent on the host cell cycle regulation in order to promote their replication or the capsid assembly resulting in S/G2 cell cycle arrest. However, it has remained unknown whether they require further cell cycle regulation during their egress from the nucleus. The aim of this study was to analyse the role of cell cycle regulation and nuclear dynamics in parvoviral nuclear egress. The nuclear egress of parvoviruses is known to occur after S/G2. To study if the cell cycle proceeds towards G2/M during the egress, the intracellular distribution and phosphorylation levels of cyclin B1, a key regulator of the G2/M transition, was investigated. Recent studies with CPV have indicated that the late-infection causes temporal interruptions in the host cell nuclear import. In this study, the relation of these phenomena on the virus nuclear egress or G2/M-phase transition was evaluated. This study shows for the first time that the nuclear egress of CPV occurs in the G2/M –phase of the cell cycle. The results indicate that late CPV-infection causes nuclear accumulation of not only importin β and cyclin B1 but also of the serine 126 and 147 phosphorylated forms of cyclin B1. Virus marginalization to the nucleus periphery near to the inner nuclear membrane prior to nuclear escape was accompanied with cyclin B1 phosphorylation at S126 and S147 and nuclear accumulation. Moreover, the intranuclear levels of these phosphorylated cyclins were increased during the progression of the infection showing gradual cell cycle progression into G2/M. Virus escape from the nucleus into the cytoplasm was followed by synchronous cytoplasmic retention of S147P cyclin B1 indicating cyclin-mediated cell cycle regulation during the nuclear egress of parvovirus capsids. Together, these results indicate that the nuclear egress of CPV is accompanied with G2/M transition or checkpoint activation. This study shows undisputably that parvoviral infection causes cell cycle progression from late S/G2 to G2/M. However, further studies are needed to clarify the signalling pathways behind the G2/M phase transition. Especially the effects of parvovirus-induced DNA damage response on the detected G2/M arrest are a significant aspect in future experiments.