Show simple item record

dc.contributor.advisorGilbert, Leona
dc.contributor.authorRauhamäki, Sanna
dc.date.accessioned2015-06-25T13:40:43Z
dc.date.available2015-06-25T13:40:43Z
dc.date.issued2013
dc.identifier.otheroai:jykdok.linneanet.fi:1476823
dc.identifier.urihttps://jyx.jyu.fi/handle/123456789/46419
dc.description.abstractVirusinfektioita pidetään kasvavissa määrin suurimpana ympäristöperäisenä syynä, joka vaikuttaa autoimmuunisairauksien kehitykseen ja autoimmuniteetin muodostukseen. Esimerkiksi parvovirus B19 (B19V) on yhdistetty punahukkaan sekä nivelreumaan. On todettu, että B19V:n ei-rakenteellinen proteiini 1 (NS1) aiheuttaa apoptoosia soluissa, jotka eivät tavallisesti ole B19V infektion kohteena. Lisäksi hiljattain on osoitettu, että apoptoosin seurauksena muodostuvat apoptoottiset kappaleet kykenevät esittelemään antigeenejä niitä esittelemään erikoistuneille soluille, kuten makrofageille tai dendriittisoluille. Tämän tutkimuksen tarkoituksena on löytää B19V infektioon liittyviä autoantigeenejä sekä tarkastella NS1:n aiheuttamaa immuunivastetta. Tätä varten NS1 on yhdistetty vihreään fluoresoivaan proteiiniin (EGFP) ja kloonattu bakulovirusvektoriin sytomegaloviruksen välittömän aikaisen promoottorin alle. Tämän jälkeen näitä yhdistelmä-bakuloviruksia lisättiin Sf9-hyönteissolulinjan avulla. Tällä tavoin tuotettua virusta käytettiin ihmisen maksasta peräisin olevien HepG2-solujen transduktiossa. Kyseisen transduktion tehokkuus mitattiin virtaussytometrillä, hyödyntäen EGFP-signaalia merkkinä onnistuneesta transduktiosta. Transduktion tehokkuuden perusteella määritettiin viruskannasta sellainen tilavuus, mikä tuottaa 70 prosentin transduktion. Tätä tilavuutta käytettiin apoptoottisten kappaleiden tuotannossa. Apoptoottiset kappaleet puhdistettiin ensin suodattamalla ja koottiin sitten pelleteiksi ultrasentrifugilla. Kootuista apoptoottisista kappaleista immunoleimattiin tumaperäiset antigeenit apolipoproteiini H (ApoH), histoni 4 (H4), histoni 2B (H2B), lysosomiin liittyvä kalvoproteiini 2 (Lamp2), Ku80 ja Smith. Kaikki tumaperäiset antigeenit, poissulkien H2B, löydettiin apoptoottisista kappaleista yhdessä NS1 kanssa. Tumaperäisten antigeenien löytyminen apoptoottisista kappaleista saattaa aiheuttaa häiriön immunitoleranssissa, mitä tutkittiin seuraavaksi hyödyntäen antigeenejä esitteleviä soluja. Tähän tarkoitukseen valittiin akuutista monosyyttisesta leukemiasta peräisin olevat ihmisen monosyytit (THP-1), jotka erilaistettiin forboli-12-myristaatti-13-asetaatilla (PMA). Soluja viljeltiin PMA:a sisältävällä kasvatusalustalla ensin kolme päivää ja viljelyä jatkettiin vielä erilaistumisen varmistamiseksi puhtaalla alustalla viiden päivän ajan. Seuraavaksi THP-1 soluja stimuloitiiin apoptoottisilla kappaleilla ja niiden päätyminen solujen sisään varmistettiin konfokaalimikroskopialla. Koska erilaistetut THP-1 solut pystyivät ottamaan apoptoottisia kappaleita sisäänsä, tästä johtuvaa sytokiiniprofiilia tarkasteltiin vielä alustavasti tarkoitukseen sopivan kaupallisen tuotteen avulla. Mahdollisia immunologisia vaikutuksia tarkasteltaessa tultiin lopputulokseen, jossa ainoastaan yhden proteiinin, γ-interferonin indusoima proteiini 10:n (IP-10), läsnäolo erotti EGFP- ja EGFP-NS1-fuusioproteiinien avulla tuotetut näytteet kontrollinäytteistä. Vaikka B19V:n infektiomekanismien aiheuttamat häiriöt immunitoleranssiin vaativatkin vielä lisätutkimuksia, tässä tutkimuksessa saadut tulokset tukevat alkuperäistä hypoteesia. B19V NS1:n avulla tuotetut apoptoottiset kappaleet, jotka ovat peräisin soluissa, joita B19V ei tavallisesti infektoi, sisältävät autoantigeenejä ja nämä autoantigeenit voidaan esitellä immuunijärjestelmälle antigeenejä esittelevien solujen kautta.fi
dc.description.abstractThere are several factors, of which viral infections are increasingly regarded as the greatest environmental cause of autoimmunity, influencing the development of an autoimmune disease. For example human parvovirus B19 (B19V) has been previously connected to systemic lupus erythematosus and rheumatic arthritis. It has also been shown that nonstructural protein 1 (NS1) of B19V induces apoptosis in cells not normally permissive for B19V infections. In addition, it has been recently demonstrated that apoptotic bodies resulting from apoptosis can present antigens to antigen presenting cells (APCs) such as macrophages or dendritic cells. The aim of this study is to detect self antigens related to B19V infections and study the immune response caused by NS1. For that, the NS1 has been fused with enhanced green fluorescent protein (EGFP) and incorporated into baculovirus vector under cytomegalovirus immediate early promoter. These recombinant baculovirus particles were amplified in Sf9 insect cell line. The resulting virus was then used to transduce HepG2 human hepatocytic cells. The transduction efficiency of the virus was measured with flow cytometry, employing the presence of the EGFP as a sign of transduction. Based on the transduction efficiency, a volume providing 70 % transduction efficiency of the virus stock was used to produce apoptotic bodies. These apoptotic bodies were first purified by filtering and then pelleted by ultracentrifugation. Collected apoptotic bodies were immunolabeled using nuclear antigens apolipoprotein H (ApoH), histone 4 (H4), histone 2B (H2B), lysosomal-associated membrane protein 2 (Lamp2), Ku80 and Smith. The selected nuclear antigens as well as NS1 were detected from the apoptotic bodies, except for H2B. The presence of nuclear antigens in the apoptotic bodies is a potential method for immune tolerance disruption which was then addressed by utilizing APCs. The APCs of choice were acute monocytic leukemia derived human monocytes (THP-1) due to their close resemblance to peripheral blood mononuclear cells. THP-1 cells were differentiated using phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA). The cells were incubated in medium containing PMA for three days and then five more days in fresh medium to ensure proper differentiation. Differentiated THP-1 cells (dTHP-1) were next fed with purified apoptotic bodies. Internalization of B19V NS1 induced apoptotic bodies was observed using confocal microscopy. Since the APCs were capable of internalizing apoptotic bodies, the following cytokine profile was tentatively studied. The examination of possible immunological effects derived to a conclusion that only the presence of interferon γ inducible protein 10 (IP-10) separated the EGFP or EGFP-NS1 fusion protein containing samples from the control conditions. Although the underlying mechanisms leading into immune tolerance disruption by B19V infection mechanisms warrants further investigation, the data here supports the hypothesis that B19V NS1 induced apoptotic bodies from nonpermissive cells contain self-antigens which could be introduced to the immune system though APCs.en
dc.format.extent1 verkkoaineisto (80 sivua)
dc.language.isoeng
dc.rightsJulkaisu on tekijänoikeussäännösten alainen. Teosta voi lukea ja tulostaa henkilökohtaista käyttöä varten. Käyttö kaupallisiin tarkoituksiin on kielletty.fi
dc.rightsThis publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.en
dc.subject.otherHuman parvovirus B19
dc.subject.otherimmune tolerance
dc.subject.otherapoptotic bodies
dc.subject.othernuclear antigens
dc.subject.otherself-antigens
dc.titleImmune tolerance disruption by human parvovirus B19 viral infection mechanisms
dc.identifier.urnURN:NBN:fi:jyu-201506252452
dc.type.ontasotPro gradufi
dc.type.ontasotMaster's thesisen
dc.contributor.tiedekuntaMatemaattis-luonnontieteellinen tiedekuntafi
dc.contributor.tiedekuntaFaculty of Sciencesen
dc.contributor.laitosBio- ja ympäristötieteiden laitosfi
dc.contributor.laitosDepartment of Biological and Environmental Scienceen
dc.contributor.yliopistoUniversity of Jyväskyläen
dc.contributor.yliopistoJyväskylän yliopistofi
dc.contributor.oppiaineSolu- ja molekyylibiologiafi
dc.contributor.oppiaineCell and molecular biologyen
dc.date.updated2015-06-25T13:40:43Z
dc.rights.accesslevelopenAccessfi
dc.contributor.oppiainekoodi4013
dc.subject.ysoparvovirukset
dc.subject.ysoantigeenit
dc.subject.ysoimmuniteetti
dc.subject.ysoohjelmoitunut solukuolema


Files in this item

Thumbnail

This item appears in the following Collection(s)

Show simple item record