Intracellular interplay between canine parvovirus with nuclear pore complex and effect of infection on RNA synthesis

Abstract

Koiran parvovirus (CPV) on halkaisijaltaan 26 nm vaipaton virus. Ikosahedraalinen kapsidi sisältää yksijuosteisen ~5kb DNA-genomin. CPV sisälleotetaan soluun endosytoosilla, jonka jälkeen se kulkeutuu endosomin sisällä kohti tumaa. CPV vapautuu solulimaan tumaa ympäröivistä lysosomeista. Genomin replikaatio ja uusien virionien kasautuminen tapahtuvat tumassa. Aikaisemmin on oletettu, että parvovirukset todennäköisesti pääsisivät tumaan tumahuokosen (NPC) kautta. Uudet tutkimukset kuitenkin viittaavat siihen että siirtyminen tumaan voisi tapahtua toista reittiä käyttäen.

CPV ja NPC proteiinien (Nup) kolokalisaatio-kokeissa selvitettiin voidaanko tiettyjä vuorovaikutuksia havaita ja missä mahdolliset vuorovaikutukset sijaitsevat. Näissä kokeissa käytettiin uutta in situ proximity ligation assay (PLA) -menetelmää, joka tuottaa fluoresenssi-signaalin kahteen eri kohdeproteiineihin sitoutuneiden vasta-aineiden sijaitessa lähellä toisiaan. Bromouridiini (BRU) on uridiinin analogi, joka voidaan tunnistaa spesifisti vasta-aineilla. Soluja viljeltiin BRU-mediumissa, jolloin BRU saatiin liitettyä kehittyviin RNA-molekyyleihin. Tämän jälkeen oli mahdollista arvioida infektiosta johtuvia muutoksia RNA-synteesissä. Fluoresenssia mitattiin virtaussytometrian ja konfokaalimikroskopian avulla.

Erityistä kolokalisaatiota ei havaittu tumakalvolla Nup358 ja viruskapsidin välillä. Sen sijaan signaali esiintyi levinneenä sytoplasmassa ja näytti siirtyvän kohti tumaa infektion edetessä. Samankaltaista sytoplasmista kolokalisaatiota nähtiin infektoimattomissa soluissa Nup153 ja Nup358 vasta-aineilla suoritetuissa kokeissa. Tämä signaali oli kuitenkin joissain soluissa vahvimmillaan tuman välittömässä läheisyydessä. Infektion myöhäisessä vaiheessa sytoplasmassa oli havaittavissa vahva signaali CPV kapsidi ja NS1 proteiinien välillä. Immunoleimaus ja virtaussytometri mittaukset osoittavat RNA-synteesin vaimentumista infektion seurauksena.

Canine parvovirus (CPV) is a non-enveloped virus with a 26 nm diameter icosahedral capsid. The capsid holds a ~5kb single-stranded DNA genome. CPV is internalized by endocytosis followed by intracellular trafficking inside an endosome towards the nucleus. CPV is released from perinuclear lysosomes followed by replication of the genome and assembly of progeny virions inside the nucleus. It has been previously assumed that parvoviruses are likely to enter the nucleus through the nuclear pore complex (NPC). Recent studies however suggest that entry to the nucleus might take place by an NPC-independent mechanism.

Colocalization of CPV and NPC proteins (Nups) were examined to find out if specific interactions could be detected and if so, where these interactions would occur. Experiments were carried out by a novel in situ proximity ligation assay (PLA) method that generates fluorescence only when two antibodies bound to different target proteins are situated at close proximity. Bromouridine (BRU) is an uridine analog that can be specifically bound by antibodies. Cells were cultured in the presence of BRU that became incorporated into nascent RNA molecules. It was then possible to estimate changes in RNA synthesis as a result of infection. The fluorescence was measured by flow cytometry and visualized by confocal microscopy.

Colocalization at the nuclear envelope was not detected between Nup358 and CPV capsid. Instead, the signal was spread across the cytoplasm and appeared to be shifting towards the nucleus in time-dependent manner. Cytoplasmic colocalization, sometimes located close to perinuclear region, was detected between Nup153 and Nup358 in noninfected cells. In a late phase of infection a very strong colocalization signal was seen between CPV capsid and NS1 proteins. Immunolabeling and flow cytometry assays suggest a decrease in the rate of RNA synthesis as a result of infection.