α2β1-integriinin ja stimuloidun epidermaalisen kasvutekijä-reseptorin reittien yhteydet

Abstract

Integriinien ja kasvutekijäreseptorien kulku solussa yhdistyy monimutkaisen vuorovaikutusten verkoston kautta. Ympäristön olosuhteista riippuvaisesti integriinit ja kasvutekijäreseptorit kantavat pääasiallisen vastuun solun selviytymisestä, kasvusta, erilaistumisesta, vaeltamisesta ja lisääntymisestä. Integriinit kiinnittävät solut alustaansa ja kasvutekijäreseptorit voivat vastata liukoisten ligandien haasteisiin. α2β1-integriinit reagoivat ligandeihinsa, joita voivat olla matriksimolekyylit, virukset ja keinotekoisesti myös vasta-aineet. Integriinien klusterointi viruksella tai vasta-aineilla aiheuttaa integriinin internalisaation endosomeihin, kun taas sitoutuminen matriksimolekyyleihin saa aikaan integriinien kulkeutumisen fokaa-liadheesioihin. Epidermaalisen kasvutekijäreseptorin (EGFR) aktivaatio on riippuvaista kasvutekijäligan-din kiinnittymisestä reseptoriin. Integriinien klusteroituminen ja EGFR:n stimulaatio johtaa reseptorien internalisoitumiseen sekä aktivoituneeseen signaalivälitykseen, jonka täytyy olla tarkasti organisoitua sekä ajallisesti että paikallisesti. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli testata α2β1-integriinin ja stimuloidun EGFR:n vuorovaikutuksia. Tutkimuksessa selvitettiin α2β1-integriinien klusteroinnin vaikutusta EGFR:n polkuun ja EGF-stimulaation merkitystä α2β1-integriinin polkuun. Lisäksi tutkittiin EGFR:n ja α2β1-integriinin internali-saatiopolkujen vuorovaikutuksia. Tutkimuksessa käytettiin immunoleimaamista, konfokaalimikroskopiaa, läpäisyelektronimikroskopiaa ja elävien solun kuvaamista laajakenttämikroskoopilla. Tulokset osoittivat, että integriinien klusterointi hidastaa EGFR:ien hajotusta, mutta EGF-stimulaatio ei vaikuta integriinien hajotukseen. Tutkimuksessa havaittiin solun pinnalla olevaa kolokalisaatiota α2β1-integriinin ja stimu-loimattoman EGFR:n välillä. Stimulaation ja internalisaation jälkeen kolokalisaatiota löydettiin kuitenkin vain vähän. Elävien solujen kuvaaminen osoitti enemmän kolokalisaatiota perustuen todennäköisesti kuvausten heikompaan resoluutioon. Tutkimuksessa tarkasteltiin myös mahdollisia kolokalisaation virhe-tulkintoja laajakenttämikroskopiakuvausten analyyseissä. Tämän tutkimuksen tuloksista voidaan päätellä, että integriinien klusterointi toimii negatiivisena säätelijänä EGFR:ien hajotukselle. Vaikka EGFR ja α2β1-integriinit kolokalisoituvat osittain solun pinnalla, internalisaation jälkeen reseptoreja sisältävät endosomit kulkivat samoja reittejä ilman merkittävää kolokalisaatiota. Huolimatta vähäisestä kolokalisaa-tiosta EGFR:n ja integriinin välillä sytoplasmisissa rakenteissa, integriinin internalisaatioreitillä on selkeä vaikutus EGFR-reitin toimintaan solussa. EGFR:n vähentynyt hajoaminen solussa mahdollisesti lisää EGFR:n signalointia solussa, pitää solua pitempään hengissä ja voi olla siten edullinen viruksen lisäänty-misen kannalta.

The pathways of integrins and growth factor receptors are connected through a complex network of inte-ractions in the cell. Depending on the environmental conditions these receptors are largely responsible for the survival, growth, differentiation, migration and proliferation of the cell. Integrins attach cells to the matrix and growth factor receptor enables cells to react to the soluble ligans. α2β1-integrins respond to their ligands i.e. matrix molecules, viruses, and artificially also antibodies. Integrin clustering by viruses or antibodies results in endocytosis of integrins to endosomes whereas binding to the matrix molecules targets integrins to focal adhesions. Epidermal growth factor receptor (EGFR) activation depends on binding of the growth factor ligand. Integrin clustering and EGFR activation result in receptor internaliza-tion and activation of signaling transduction pathways which have to be precisely orchestrated spatially and temporally. The aim of this study was to test the interactions between α2β1-integrin and EGFR triggered pathways. The objective of this study was to examine the clustering effects of α2β1-integrin on EGFR pathway and the effects of EGF-stimulation on α2β1-integrin pathway. Furthermore the interactions of the internaliza-tion pathways of EGFR and α2β1-integrin were studied. The testing included immunolabelling experi-ments, confocal fluorescence microscopy, transmission electron microscopy, and live-cell imaging. The results indicated that the clustering of integrins delay the degradation of EGFR but no effect on the deg-radation of integrins was discovered by the EGF-stimulation. In this study colocalization on the cell sur-face was observed between α2β1-integrin and unstimulated EGFR. However, after stimulation and inter-nalization very low levels of colocalization were found. The live cell imaging showed higher colocaliza-tion probably based on poor resolution. The possible misinterpretations of colocalization concerning the analysis of wide-field microscopy were also under consideration. Findings of this study suggest that the clustering of integrins functions as a negative regulator for EGFR degradation. Though EGFR and α2β1-integrin partly colocalize on the cell surface, after internalization, endosomes containing receptors fol-lowed the same routes without considerable colocalization. Regardless of the low colocalization between EGFR and integrins in the cytoplasmic structures, integrin internalization pathway clearly contributes to the EGFR route in the cell. Reduced degradation of EGFR in the cell probably enhances EGFR signal-ing, prolongs the life-time of the cell and may be thus advantageous to the proliferation of virus.