The effect of PLC-inhibitor on echovirus 1 internalization probed with fluorescently labeled echovirus 1

Abstract

Echovirus 1 (EV1) kuuluu Pikornavirusperheeseen ja tarkemmin luokiteltuna Enterovirusten sukuun. EV1 on pieni ja vaipaton RNA-virus, jonka proteiinikuori koostuu neljästä proteiinista VP1-VP4. Infektion on osoitettu alkavan, kun EV1 tarttuu α2β1-integriiniin solun pinnalla, jonka jälkeen virus otetaan solun sisään kaveoliinivälitteistä endosytoosia sekä makropinosytoosia muistuttavalla mekanismilla. Toisaalta sitä, kuinka virus avautuu sekä vapauttaa RNA:nsa, ei vielä tarkalleen tiedetä. Tässä tutkimuksessa EV1 puhdistettiin ensin sakkaroosigradientilla, jonka jälkeen virus leimattiin fluoresoivalla amiinireaktiivisella värillä. Tulokset osoittivat, että leimauksen onnistumiseksi tarvitaan suhteellisen vähäinen leimamäärä, ja että vähäinen leimamäärä riittää fluoresenssin havaitsemiseksi sekä on tärkeä viruksen infektiivisyyden säilyttämiseksi. Leimattua EV1:stä käytettiin solukokeissa, joissa Fosfolipaasi C inhibiittoria (PLC-inhibiittori) käytettiin viruksen endosytoosin estämiseen, jolloin asettamamme hypoteesin mukaan endosytoosia ei tapahdu, vaan virus jää solun pinnalle. Immunofluoresenssikokeiden ja kvantitatiivisen analysoinnin perusteella endosytoosi estyi, vaikkakin ero kontrollisoluihin oli ainoastaan 10 %. Lisäksi toinen immunofluoresenssikoe osoitti, että EV1:n infektiivisyys laski käytettäessä PLC-inhibiittoria. Immunofluoresenssikokeissa ongelmia aiheuttivat tyhjät ja rikkinäiset viruspartikkelit, jotka havaittiin EV1:n karakterisoinnin aikana läpäisyelektronimikroskoopilla. Leimautuneet tyhjät ja rikkinäiset partikkelit aiheuttivat todennäköisesti väärää signaalia immunofluoresenssikokeissa, joiden perusteella voitiin todeta, että viruksen puhdistaminen ja leimaaminen vaativat lisää optimointia. Suora kapsidileima voisi onnistuessaan toimia työkaluna tulevissa viruksen avautumiskokeissa ja livetutkimuksissa, jolloin vasta-aineleimauksiin liittyvä taustafluoresenssi saataisiin minimoitua. Lisäksi PLC-inhibiittori voisi mahdollistaa viruksen avautumisen tutkimisen solun pinnalla endosomaalisten rakenteiden sijaan.

Echovirus 1 (EV1) belongs to the family of Picornaviridae and more specifically to the genus Enterovirus. EV1 is a small, non-enveloped RNA-virus which has a capsid consisting of four proteins VP1-VP4. EV1 has been shown to bind to α2β1-integrin on the cell surface and then endocytosed inside the cell by a mechanism that resembles both caveolin-mediated endocytosis and macropinocytosis. Instead, uncoating and RNA release are poorly understood. Here, we have successfully purified EV1 with sucrose gradient and labeled the virus with an amine reactive dye. The results showed that for successful labeling, considerably low amount of dye is sufficient for signal detection, and according to end-point dilution assay, is necessary for maintaining virus infectivity. Capsid labeled EV1 was used in cellular studies where Phospholipase C-inhibitor (PLC-inhibitor) was tested as an endocytosis blocker. According to our hypothesis PLC-inhibitor blocks endocytosis, and as a result, virus remains on the cell surface. Indeed, based on immunofluorescence studies and quantification with Bioimage XD software, endocytosis was blocked, although difference to control cells was only 10%. Additionally, another immunofluorescence study showed that PLC-inhibitor decreased EV1 infection. Immunofluorescence studies were hindered by empty and disassembled virus particles, which were detected during EV1 characterization with transmission electron microcopy. Labeled empty and disassembled particles probably caused false signal in immunofluorescence studies, and thus, it was concluded that virus purification and labeling has to be more optimized for these kinds of studies. Fluorescent capsid label could provide us a tool for future uncoating and live imaging studies by minimizing non-specificity that is usually related to immunolabeling. In addition, PLC-inhibitor could enable uncoating studies to be carried out on the cell surface instead of endosomes.