Genetic methods for detection of plant-associated aerobic anoxygenic phototrophic bacteria

Abstract

Aerobiset happeatuottamattomat yhteyttävät bakteerit (eng. aerobic anoxygenic phototrophic bacteria – AAPB) ovat polyfyleettisia ja toisenvaraisia esitumallisia, jotka kykenevät yhteyttämään happipitoisissa elinympäristöissä. AAPB löytyvät monenlaisista terrestrisista ympäristöistä ja niitä löydetään myös kaikissa happipitoisissa vesistöissä. Metagenomiset ja bakteeriviljelyyn perustavat tutkimukset ovat osoittaneet, että niitä löytyvät myös kasvien päältä ja sisältä. Tämä tutkielma pyrkii kehittämään menetelmän amplikonien avulla AAPB:n yhteisön kasvin kartoitukseen. Usein käytettyjen alukkeiden tarkuutta ja herkkyyttään tarkasteltiin kayttäen kahdeksaa AAPB kantaa ja DNA:sta sekä puolukan (Vaccinium vitis-idaea) lehtien pinnoilta että kudoksista. Alukkeet pufM_uniF ja pufM_uniR osoitettiin olevan sopivimpia tähän tehtävään, ja niiden tehokkuutta optimoitiin ympäristöperäisten näytteiden kanssa. Kehitettyä menetelmää verrattiin rinnakkaissekvensointimenetelmään. Samalla analysoittiin koko bakteeriyhteisörakennetta ja havaittiin, että Methylobacteria ovat yleisin tutkittujen kasvien AAPB-suku. Epifyyttiset AAPB:t esiintyvät endofyyttisiä runsaammin sekä monipuolisemmin. Ainoastaan yksi AAPB laji Sphingomonas-suvusta löytyi ja vain yhdeltä näytteeltä, vaikka tämä suku todistettiin olevaksi yleisin bakteeri-sekvenssidatassa. Lisäksi, käytetyt alukkeet olivat erityisen herkkiä tätä sukua kohta. Esitetty menetelmä toimii hyvänä pohjana pufM_uniF/pufM_uniR perustuviin AAPB tunnistamiseen kasveista. Ne ovat erityisen sopivia epifyyttejä analysoinnissa. Vähäinen AAPB määrä endosfääristä saattaa johtua luonnollisen vähäisestä määrästä tai toisaalta amplikoni-menetelmän haasteista kasvikudosnäytteissä. Tulevaisuudessa endofyyttisten näytteiden analyysimentelmää tulee kehittää, jolloin AAPB:n esiintyvyys kasvien sisällä voidaan kartoittaa tarkemmin.

Aerobic anoxygenic phototrophic bacteria (AAPB) are a polyphyletic class of heterotrophic prokaryotes capable of anoxygenic photosynthesis in oxygenated environments. Since their discovery, they have been found in a great diversity of terrestrial niches and are considered ubiquitous in aerated bodies of water. The few metagenomic and culture-based studies that have investigated their presence and role in plants show that AAPB are also common in the phyllosphere. This study aims to augment research of plant-associated AAPB through the development of amplicon-based genetic methods. The specificity and sensitivity of frequently used AAPB-primers were evaluated using both a screen of AAPB isolated from plants, and DNA from the surface and tissue of lingonberry (Vaccinium vitis-idaea) leaves. pufM_uniF/pufM_uniR were shown to be the most suitable primers. Multiple variations in their PCR protocol were investigated to test if their efficacy with environmental samples could be optimized. Extensibility of these methods to community-analyses of plant-associated AAPB was evaluated with next-generation sequencing (IonTorrent PGM). In concert, the eubacterial population was analysed through 16S ribosomal gene fragments. Results from the sequence data indicate that Methylobacteria are the most dominant AAPB genus found in the samples, and that epiphytic AAPB present in greater abundance and species diversity than endophytic AAPB. Only a single species of the genus Sphingomonas was found in the AAPB sequences, despite the primers being proven to be particularly sensitive to them and it being the most abundant genus in the eubacterial sequence data. Our results show that the techniques developed offer a good framework for future studies. More specifically, the sequence data show that primers pufM_uniF and pufM_uniR have good sensitivity and species coverage for plant-associated AAPB, and that they are well suited for analysis of epiphytic AAPB. The low number of detected endophytes may be due to their natural low abundance, and/or the inherent difficulty amplicon-based methods have with tissue extracts. Future work should validate the full range of AAPB taxa that can be detected and the potential effects that low abundance may have on results.