3D imaging and analysis of skeletal muscle arterial network structure in response to exercise training in normal and overweight mice

Abstract

Regular physical activity produces beneficial effects on health in obesity, especially for the vascular system. Three-dimensional imaging (3D) using tissue clearing techniques aids in studying complex structures like vasculature. However, only one preliminary study has examined the 3D skeletal muscle vasculature using similar technique. Since this method has not been extensively studied before, this thesis aimed to develop the method for whole mouse muscles and to investigate the effects of exercise on skeletal muscle arterial network using 3D imaging in normal and overweight mice. Adult C57BL/6J male mice (n=40) were divided into four groups: lean sedentary, lean exercise, obese sedentary and obese exercise. Obesity, hyperglycemia and insulin resistance were induced using a Western diet for 18 weeks. The exercise groups had free access to running wheels for the last 9 weeks within their cages. The entire intervention lasted 18 weeks. Tibialis anterior muscles of mice (n=12, 3/group) were stained with SMA-Cy3 antibody to visualize the arterial network and cleared for 3D vascular structure analysis utilizing light sheet microscopy and Imaris software. Other methods utilized in this study included body composition analysis, glucose tolerance test and maximal running capacity test. Body weight and fat percentage were significantly increased in the obese mice. However, glucose tolerance was impaired only in the obese sedentary group (p<0.0001), demonstrating the metabolic health benefit of exercise in the obese mice. The development of the 3D imaging protocol was successful and visual analysis with Imaris enabled the exploration of the 3D arterial structure. The 3D quantitative analyses revealed no statistically significant differences in arterial characteristics such as area, volume, total length, branch length, diameter, branch level and depth between the groups. 3D visualization of muscles using whole mount staining and iDISCO tissue clearing protocol proved effective in analyzing skeletal muscle arterial vasculature. With this rather small sample size, the results indicate that the arterial network was not affected by exercise and obesity. Further studies using a larger sample size needs to be conducted to evaluate these effects in more detail.

Säännöllinen fyysinen aktiivisuus tarjoaa lukuisia terveyshyötyjä ylipainoisille, erityisesti verisuoniston kannalta. Kolmiulotteinen kuvantaminen mahdollistaa monimutkaisten rakenteiden, kuten verisuoniston, tutkimisen. Kolmiulotteisen kuvantamisen ja analyysin apuvälineenä voidaan käyttää kudosläpäisytekniikkaa, jonka tarkoituksena on vähentää valon sirontaa tekemällä näytteestä läpinäkyvä. Tämän tutkielman tavoitteena oli tarkastella liikunnan aiheuttamia vaikutuksia luustolihasten valtimoverkoston rakenteeseen käyttäen kolmiulotteista kuvantamista normaalipainoisilla ja ylipainoisilla hiirillä. Aikuiset C57BL/6J uroshiiret (n=40) jaettiin neljään ryhmään: laihat liikkumattomat, laihat liikkuvat, ylipainoiset liikkumattomat ja ylipainoiset liikkuvat. Kokeen kokonaispituus oli 18 viikkoa. Lihavuus, hyperglykemia ja insuliiniresistenssi aiheutettiin koko kokeen ajan kestävällä korkearasvaisella ruokavaliolla. Jälkimmäiset 9 viikkoa liikkuvien ryhmillä oli häkeissään vapaa pääsy juoksupyörille. Hiirten etummaiset säärilihakset (n=12, 3/ryhmä) värjättiin SMA-Cy3-vasta-aineella ja tehtiin läpinäkyväksi 3D verisuonirakenteen analysointia varten. 3D analyysit tehtiin valomikroskooppia ja Imaris-analyysiohjelmaa hyödyntäen. Tutkimuksessa käytettiin myös kehonkoostumusmittausta, glukoositoleranssitestiä ja maksimaalista juoksutestiä kuvaamaan hiirten fysiologisia ominaisuuksia. Ylipainoisilla hiirillä kehon paino ja rasvaprosentti kasvoivat merkittävästi. Kuitenkin glukoositoleranssi oli heikentynyt vain liikkumattomien ylipainoisten ryhmällä (p<0,0001), mikä osoittaa liikunnan positiivisen hyödyn metabolisen terveyden kannalta ylipainoisilla hiirillä. 3D-kuvantamisprotokollan kehitys onnistui ja se mahdollisti visuaalisen ja numeraalisen 3D-valtimorakenteen analysoinnin Imaris-ohjelmaa hyödyntäen. Kvantitatiiviset analyysit eivät paljastaneet tilastollisesti merkitseviä eroja valtimoiden pinta-alassa, tilavuudessa, kokonaispituudessa, haaran pituudessa, halkaisijassa, haaran tasoilla eikä haarojen syvyydessä. Lihasten 3D-visualisointi koko kudoksen värjäyksellä ja iDISCO-kudosläpäisytekniikalla osoittautui tehokkaaksi protokollaksi luurankolihaksen verisuoniston analysoinnissa. Tämän tutkimuksen tulosten perusteella liikunta ja lihavuus eivät vaikuta merkittävästi valtimoverkoston rakenteeseen. Tulevaisuudessa tarvitaan kuitenkin tutkimusta suuremmalla otoskoolla.