The visualization and analysis of cell polarity based on dynamic fluorescence images

Abstract

Biosensors fused with fluorescent proteins can now track the dynamics of proteins and protein-protein interactions in living cells. The live-cell imaging with these biosensors enables monitoring cellular processes in real-time, opening possibilities to reveal hitherto hidden information about cellular processes if processing the images effectively. This thesis develops methods to analyze dynamic fluorescence images for visualizing the cell polarity dynamics upon shear stress by pipelining the analysis to the preprocessing and the formal polarity analysis. The preprocessing section utilizes a two-step segmentation combining Otsu’s method with a high-pass filter to rapidly obtain refined cell edge. It proposes a new algorithm based on k-means clustering to identify focal adhesions stably, which extracts the potential polarity regions accurately and reliably and reduces the defects due to human factors in the earlier methods. The polarity analysis section applies to different forms of polarity. It quantifies the analysis by normalizing the cell with zones to analyze the polarity distributed in the whole cell and defining upstream/downstream based on the incident angle between the cell edge and the external forcing to detect the polarity occurring on subcellular structures, enlarging the application range of cell polarity analysis. The analysis results show a pathway to sense and transduce the extracellular mechanical signals to intracellular force and transmit the force to the remote sites through membrane fluidity and cytoskeleton to activate signaling proteins and establish cell polarity. In summary, the thesis considers polarity analysis based on dynamic fluorescence images as an independent issue for the first time, establishes an integrated pipeline to obtain polarity information at both cellular and subcellular scales, improves the accuracy and reliability of polarity analysis, and further provides an efficient tool to analyze different forms of polarity. It promotes the application of fluorescent proteins related techniques in exploring cellular processes, offers new insights to explain the establishment of cell polarity, and further advances how mechanotransduction occurs in cells.

Keywords: fluorescent protein, live-cell images, cell polarity, mechanotransduction, image processing

Fluoresoituviin proteiineihin perustuvat biosensorit pystyvät seuraamaan elävän solun proteiinien dynamiikkaa. Tämä mahdollistaa solun sisäisten prosessien monitoroinnin ja avaa näkymiä tähän asti tuntemattomiin mekanismeihin, mikäli biosensorien signaaleja osataan tulkita luotettavasti. Työssä kehitettiin menetelmiä soveltaa fluoresenssiin perustuvaa dynaamista kuvantamista solujen polarisoitumismekanismeihin. Menetelmiä kehitettiin sekä kuvien esikäsittelyyn että itse polarisoitumisdynamiikan tunnistamiseen. Esikäsittelyn tavoite on tunnistaa tarkasti solun reunat ja edelleen solun fokaaliset liitokset. Kuvat segmentoidaan Otsun menetelmällä, reunoja korostetaan ylipäästösuotimilla ja fokaaliset liitokset tunnistetaan K-means klusteroinnilla. Näin saadaan sekä solun muodosta että liitosten paikoista luotettavampi ja toistettavampi tieto kuin aiemmilla asiantuntijan silmämääräiseen arvioon perustuvilla menetelmillä. Polaarisuuden analyysimenetelmät perustuvat solujen vyöhykejakoon, jolla normalisoidaan solujen kokovaihtelu solujen sisäisessä polaarisuudessa. Solun reunalla puolestaan polaarisuus suhteutetaan solun reunan ja ulkoisen kuormituksen kohtauskulmaan, mikä mahdollistaa solujen muotovaihtelujen paremman huomioinnin. Menetelmien avulla voitiin tunnistaa, miten solut tunnistavat ulkoisen kuormituksen ja välittävät sen mekaanisesti ja biokemiallisesti solun eri osiin. Solukalvon joustavuuden ja sisäisen tukirangan osuudesta solun polaarisuudessa ja signaaliproteiinien aktivoinnissa saatiin näin uutta tietoa. Yhteenvetona, työssä käsitellään ensimmäistä kertaa solun polaarisuuden analyysiä dynaamisen fluoresenssikuvauksen avulla omana tutkimusongelmanaan. Polaarisuuden havainnointiin kehitettiin menetelmäkokonaisuus, joka soveltuu sekä solutason että solun alarakenteiden polarisoitumismekanismien analyysiin, parantaa tarkkuutta ja luotettavuutta suhteessa aiempiin menetelmiin ja soveltuu niin solun sisäisen kuin solun pintarakenteisiin liittyvän polaarisuuden analysointiin. Työ tukee fluoresoituvien proteiinien hyödyntämistä solutason prosessien tutkimuksessa, lisää ymmärrystä solun polaarisuuden syntymekanismeista ja yleisemminkin mekaanisten voimien vaikutuksesta soluihin.

Avainsanat: fluoresoituvat proteiinit, solujen kuvantaminen, solujen polaarisuus, mekanotransduktio, kuvan käsittely