The role of cellular cytoskeleton in the egress of Coxsackievirus B3

Abstract

Enterovirus-sukuun kuuluva Coxsackievirus B3 aiheuttaa vakavia sairauksia mm. sydänlihastulehdusta, kardiomyopatiaa ja tyypin 1 diabetesta. CVB3 on yksijuosteita RNA:ta sisältävä virus, joka replikoituu solun sytoplasmassa. CVB3 infektion loppuvaiheessa solun solukalvosta kuroutuu ulospäin aktiinia sisältäviä pitkänomaisia kalvoulkonemia. Näiden rakenteiden on arveltu mahdollistavan CVB3-virukselle epätyypillisen, ei-lyyttisen poistumisen isäntäsolusta ja leviämisen solusta toiseen. Tässä työssä tarkasteltiin viruksen solusta poistumista ja selvitettiin miten solutukirankaan vaikuttavat inhibiittorit säätelevät CVB3-infektion etenemistä ja viruksen aiheuttamien kalvoulkonemien muodostumista green monkey kidney (GMK) soluissa. Käytimme inhibiittoreita, jotka aiheuttavat aktiinitukirangan ja mikrotubulusten stabiloimisen tai depolymerisaation. Lisäksi tutkimme miten myosiini II:n, myosin light chain -kinaasin (MLCK), RhoA-kinaasin (ROCK) ja MAP-kinaasin inhibitio vaikuttaa viruksen aiheuttamiin morfologisiin muutoksiin ja kalvoulkonemien muodostumiseen. Analysoimme CVB3-infektoituja ja inhibiittorikäsiteltyjä apinan munuaissoluja virtaussytometriaa ja konfokaalimikroskopiaa hyödyntäen. Analyysiemme tulokset osoittivat, että solutukirangan molekyyleja ja kinaaseja inhiboimalla, infektoituneiden GMK solujen määrä pieneni merkittävästi. Mikroskooppikuvista nähdään, että jotkut inhibiittorit (phalloidin ja nocodazole) myös ehkäisivät CVB3-infektion aiheuttamia morfologisia muutoksia GMK soluissa. Lisäksi huomasimme, että ROCK:n ja MLCK:n inhibointi tai aktiinitukirangan stabiloiminen phalloidiinilla, mahdollisesti heikentää CVB3-partikkeleiden ei-lyyttistä poistumista isäntäsolusta. Vaikka mikrotubulusten kemiallinen pirstominen vähensi huomattavasti CVB3-infektoitujen solujen määrää, ei mikrotubulusten inhibitio kuitenkaan estänyt CVB3:n aiheuttamien kalvoulkonemien syntymistä Tutkimustuloksemme tukee dynaamisen aktiinitukirangan merkitystä CVB3:n ei-lyyttiselle poistumiselle.

Coxsackievirus B3 (CVB3) is an enterovirus that has an impact on severe diseases including myocarditis, cardiomyopathy, and type 1 diabetes. The infection of CVB3 has been noticed to alter the morphology of green monkey kidney cells by forming cage-like protrusions to the host cell membrane. The protrusions were found packed with actin filaments and viral capsids, thus, hypothesizing an atypical, non-lytic way of spreading from the host cell to another. To further examine the non-lytic pathway and the role of cellular cytoskeleton, stabilizing and depolymerizing inhibitors of actin and microtubules were used. The inhibition of myosin II, myosin light chain kinase (MLCK), RhoA-kinase (ROCK) and mitogen-activated kinase were also examined to see the structural and transcriptional effect on the morphological changes and protrusion formation. The CVB3-infected and drug-treated GMK cells were analyzed with fluorescent-activated cell sorting (FACS) and confocal laser scanning microscopy. Our analyses showed that inhibition of the cytoskeleton filaments and cell kinases decreases the number of CVB3 infected cells. According to the confocal microscopy images, the strongest inhibitors (phalloidin and nocodazole) also prevented some of the characteristic changes in the cell morphology normally seen in CVB3 infection. Our findings also suggest that inhibition of ROCK or MLCK or actin stabilizing with phalloidin could interfere with the nonlytic egress of CVB3. Although, microtubule depolymerization significantly inhibited the number of CVB3 infected cells, the microtubule inhibition did not prevent the emergence of CVB3-induced protrusions. Overall, our results were promising, and this work further establishes that a dynamic actin cytoskeleton plays an essential role in the possible non-lytic egress of CVB3.