Structural and functional characterization of the cell wall-targeting domain of lysostaphin with NMR spectroscopy

Abstract

Src-homologi 3 (SH3) domeenit ovat solun signaalireiteillä toimivia välttämättömiä, ei-katalyyttisiä domeeneja. Kuten monilla muilla aitotumaisten solujen proteiineilla tai domeeneilla, myös SH3-domeeneilla on homologinen SH3b-domeeni bakteerisoluissa. Rakenteellisesti nämä kaksi ovat samanlaisia muodostaen viiden beetasäikeen rungon, jota täydentävät erilaiset silmukkarakenteet. Näillä silmukkarakenteilla on merkitystä mm. domeenien toimintaan ja koska ne ovat yleisesti ottaen erilaisia SH3- ja SH3b-domeenien välillä, domeenien on oletettu olevan toiminnaltaan erilaisia. SH3-domeenit ovatkin hyvin tutkittuja ja niiden toimintaperiaatteet tiedetään, mutta niiden bakteerihomologit ovat vielä suhteellisen tuntemattomia. Eräs tällainen on soluseinän peptidoglykaania (PG) pilkkovan proteiinin, lysostafiinin, soluseinään kohdistuva domeeni, jolla on SH3b-laskos. Lysostafiini on Staphylococcus simulansin biovaarin staphylolyticuksen erittämä proteiini, joka kyseisen domeenin avulla kohdistetaan lähisukuisen Staphylococcus aureus -bakteerin soluseinälle. Soluseinällä lysostafiini hajottaa PG:tä ollen siten antimikrobinen, mutta tätä ominaisuutta ei vieläkään tunneta tai hyödynnetä täysin. Tässä työssä lysostafiinin soluseinään kohdistuvan domeenin rakennetta ja toimintaa tutkittiin ydinmagneettisen resonanssin avulla. Sekvenssikohtaisen kemiallisten siirtymien assignoimiseksi sekä dynamiikan ja sitoutumisominaisuuksien määrittämiseksi mitattiin useita spektrejä. Tuloksena saatiin 94,3 % pääketjun amidiryhmistä sekä 85,2 % sivuketjujen 1H- ja 13C-siirtymistä assignoitua. Relaksaatiomittausten ja dynamiikka-analyysin perusteella domeenin havaittiin olevan ligandin sitoutumiskohta mukaan lukien suhteellisen jäykkä. Ainoastaan β3-säie osoittautui muuta rakennetta joustavammaksi. Mielenkiintoista on se, että tämä säie on osa suurta silmukkaa, jonka rakenteelliset erot SH3- ja SH3b-domeenien välillä aiheuttavat osaltaan näiden toiminnallisen eroavaisuuden. Soluseinään kohdistuvan domeenin tiedetään sitoutuvan PG:n pentaglysiinisiltoihin. Ligandin sitoutumiskohtaa tutkittiin tarkemmin PG:tä jäljittelevällä peptidillä, L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala-GGGGG-L-Ala-D-Glu-D-Lys-D-Ala. Tulokset vahvistavat aiemmin määritetyn sitoutumiskohdan sijainnin sekä tukevat hypoteesia, jonka mukaan pentaglysiinin ympärillä olevat aminohapot PG:ssä osallistuisivat vuorovaikutukseen. Vuorovaikutuksen dissosiaatiovakioksi määritettiin ~3 mM. Työn tuloksena saatiin arvokasta tietoa lysostafiinin soluseinään kohdistavan domeenin rakenteellisista ominaisuuksista ja sen sitoutumisesta PG:iin, ja tuloksia voidaan hyödyntää myöhemmissä tutkimuksissa.

Src homology 3 (SH3) domains are essential, small non-catalytic domains involved in intracellular signaling processes in eukaryotic cells. As many other eukaryotic proteins or domains, these also have their prokaryotic homologues, designated as SH3b domains. Structurally similar to each other, they adopt a conserved core of five β-strands surrounded by more variable loop structures. These loops, having a huge impact on ligand binding properties, generally differ between these domains for which functionally they are distinct. Although SH3 domains are well characterized, their prokaryotic homologues are still somewhat uncharted. One such is a cell wall-targeting (CWT) domain of peptidoglycan (PG)-cleaving protein, lysostaphin. Secreted by Staphylococcus simulans biovar staphylolyticus, lysostaphin is targeted via its SH3b-folded CWT domain to the cell wall of its close relative, Staphylococcus aureus. Once there, lysostaphin acts as a bacteriocin and degrades the PG, thus, displaying antimicrobial potential that, however, is still incompletely exploited. Here, functional and structural properties of the lysostaphin-CWT domain are studied with nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Several multidimensional NMR spectra were recorded in order to assign backbone and side chain resonances and to define protein dynamics and binding properties of the CWT domain. As a result, 94.3 % of backbone and 85.2 % of side chain resonances of the CWT domain have been assigned. Protein dynamics described by relaxation measurements and model-free analysis imply that the CWT domain is relatively rigid. A binding groove for its ligand, a pentaglycine bridge in the PG, shows no exception to this. The only relatively mobile part is the β3-strand which is interestingly a part of the loop structure causing main functional differences between SH3 and SH3b domains. The binding groove was further studied with a PG-mimicking peptide L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala-GGGGG-L-Ala-D-Glu-D-Lys-D-Ala. Results are in accordance with previous results obtained with pentaglycine (KGGGGG or GGGGGK) and further indicate that additional residues surrounding the pentaglycine truly enhanced the binding. Dissociation constant for the PG-mimicking peptide was determined to be ~3 mM. Results obtained here bring out novel information about structural properties and functional characteristics of the CWT domain, and they can be exploited in subsequent studies.