Branched-chain amino acid metabolism and estrogen modification during adipogenesis

Abstract

Lihavuus yhdistetään metabolisiin sairauksiin kuten tyypin 2 diabetekseen, sekä useiden molekyylien ja hormonien muuttuneisiin pitoisuuksiin verenkierrossa. Lihavilla henkilöillä muun muassa haaraketjuisten aminohappojen (BCAA) määrä verenkierrossa on kohonnut. Rasvakudos osallistuu BCAA:n metaboliaan ja systeemisten tasojen säätelyyn, ja muutokset rasvakudoksen toiminnassa ovat yhteydessä havaittuihin, lihavuuteen liitettyihin komplikaatioihin. Ravintoaineiden jatkuva liikasaanti lisää rasvasolujen kehittymistä. Rasvasolut erilaistuvat esiasteistaan adipogeneesin aikana, jolloin solujen BCAA:n käyttö lisääntyy. Estrogeenin on toisaalta havaittu estävän adipogeneesia, rasvakudoksen kasvua ja vähentävän metabolisten sairauksien todennäköisyyttä. Aikaisemmin BCAA-metaboliaa ja estrogeenin vaikutuksia on tutkittu pääasiassa ihmisen rasvakudoksesta eristetyillä rasvasoluilla sekä in vitro ja in vivo eläinmalleilla. Tässä gradussa adipogeneesia ja sen aikaisia muutoksia BCAA-metaboliaan osallistuvien geenien ilmentymisessä tutkittiin ihmisen Simpson-Golabi-Behmel Syndrome (SGBS) rasvasoluilla. Lisäksi haluttiin selvittää estrogeenin vaikutukset adipogeneesiin ja kyseisten geenien ilmentymiseen. Rasvasolujen erilaistumista seurattiin 14 päivän ajan viidessä eri aikapisteessä, 0., 4., 7., 10. ja 14. päivänä. Adipogeneesia ja BCAA-metaboliaan osallistuvien geenien ilmentymistä tutkittiin transkriptiotasolla kvantitatiivisen PCR:n avulla, ja erilaistumisen aikaista lipidien kerääntymistä soluihin seurattiin Oil Red O -värjäyksen avulla. Estrogeenin vaikutuksia tutkittiin altistamalla solut 24 tunnin ajan kolmelle eri estradioli (E2) -pitoisuudelle sekä kontrollikäsittelylle ilman E2:a ennen jokaista aikapistettä, lukuun ottamatta 0. päivää. Tutkittujen geenien ilmentyminen muuttui adipogeneesin aikana, ja useat BCAA-metaboliaan osallistuvat geenit ilmenivät voimakkaasti 4. päivänä. Adipogeneesin säätelyyn osallistuvan pparg-geenin ja isoleusiinin metaboliaan osallistuvan hadhb:n ilmentymisen voimistuminen 0. ja 4. päivän välillä oli tilastollisesti merkitsevää. Adipogeneesia säätelevien tekijöiden tuotanto ja BCAA-metabolia täten aktivoituvat rasvasolujen erilaistumisen alkuvaiheessa. E2-käsittelyt eivät vaikuttaneet merkittävästi lipidien kerääntymiseen soluihin. 1 nM E2 toisaalta laski adipogeneesin säätelyyn osallistuvan medag:n ilmenemistä 14. päivänä merkitsevästi, mutta E2 ei muuten vaikuttanut merkitsevästi adipogeneesia säätelevien geenien tai estrogeenireseptoreja koodaavien geenien ilmentymiseen. BCAA-metaboliassa, 100 nM E2 voimisti bcat1:n ilmentymistä 4. päivänä, kun taas 14. päivänä 1 nM E2 lisäsi bcat1:n ilmentymistä ja laski hmgcr:n ilmentymistä verrattuna 100 nM E2 -käsittelyyn. Tulosten perusteella voidaan olettaa, että E2 voi säädellä BCAA-metaboliaa geenitasolla vaikuttamalla bcat1:n ilmentymiseen adipogeneesin alku- ja loppuvaiheessa, ja hmgcr:n ilmentymiseen adipogeneesin loppuvaiheessa. Rasvasolut tulivat herkemmiksi E2:lle erilaistumisen myötä. Erilaistumisen alkuvaiheessa suuret E2 pitoisuudet ja loppuvaiheessa pienemmät pitoisuudet voivat aiheuttaa merkitseviä muutoksia geenien ilmentymisessä. Pienen otoskoon ja mahdollisten menetelmällisten virheiden takia työn tuloksia tulee kuitenkin tarkastella ja tulkita kriittisesti. Lisätutkimuksia kaivataan selvittämään, voiko E2 säädellä BCAA-metaboliaa estrogeenireseptorien ei-genomisen säätelyn kautta ja proteiinitasolla. Kaiken kaikkiaan tämä työ antaa uutta tietoa BCAA-metaboliaan osallistuvien geenien ilmentymisestä E2-altistuksessa sekä adipogeneesiin osallistuvan medag:n ilmentymisestä ihmisen SGBS rasvasoluissa niiden erilaistumisen aikana.

Obesity is associated with metabolic diseases such as type 2 diabetes, as well as altered plasma levels of several hormones and nutrients. For instance, levels of branched-chain amino acids (BCAA) in circulation are elevated in obese subjects. White adipose tissue (WAT) takes part in the metabolism of these amino acids and regulation of their systemic levels, and impaired metabolism of WAT is linked to these detected, obesity-associated complications. In the body, excess of nutrients leads to increased size of adipose tissue, and increased number and size of mature adipocytes. Adipocytes differentiate from their precursor cells during adipogenesis, which is associated with increased utilization of BCAAs. However, estrogen can to inhibit adipogenesis, adipose tissue growth, and probability of metabolic diseases. Previously, BCAA metabolism and effects of estrogen have been studied mainly using human primary adipocytes, and in vitro and in vivo animal models. In this thesis, adipogenesis and adipogenesis-associated changes in expression of BCAA metabolism involved genes were studied with human Simpson-Golabi-Behmel Syndrome (SGBS) adipocytes. In addition, effects of estrogen on adipogenesis and expression of these genes were assessed. Adipogenesis was followed for 14 days, at 5 different time points, at days 0, 4, 7, 10 and 14. Adipogenesis was followed at transcription level by analyzing expressions of adipogenesis-associated transcription factors and BCAA metabolism involved genes with real-time PCR, and by observing the lipid accumulation using Oil Red O staining. To assess the effects of estrogen, adipocytes were exposed to three different estradiol (E2) concentrations and a mock treatment without E2, 24 h prior to every time point, excluding the day 0. We found that expression of all studied genes changed during adipogenesis, and several genes were upregulated at day 4. Expressions of adipogenic pparg and isoleucine degradation pathway involved hadhb were significantly increased between the days 0 and 4, indicating that early differentiation stages are associated with upregulation of adipogenic transcription factors and BCAA metabolic pathway. E2 treatments didn’t significantly affect lipid accumulation, or expression of adipogenic transcription factors, or estrogen receptors. However, 1 nM E2 did significantly decrease adipogenesis-associated medag expression at day 14. In BCAA metabolism, 100 nM E2 upregulated bcat1 significantly at day 4; whereas at day 14, 1 nM E2 downregulated bcat1 but upregulated hmgcr, involved in leucine degradation pathway, compared to 100 nM E2. Results, here, indicate that E2 can modify BCAA metabolism at transcription level mainly by regulating bcat1 expression at early and late stages of differentiation, and hmgcr expression at late stages. Adipocytes became more sensitive to E2 during their differentiation. While a higher E2 dose is needed to evoke marked responses in gene expression levels at early stages of adipogenesis, lower E2 doses can elicit subtle but significant responses at later stages. Due to the small sample size and possible errors during the study, these findings should be interpreted with caution. To assess whether E2 can regulate BCAA metabolism through estrogen receptor mediated nongenomic effects and at protein level, more studies should be made. Overall, this study provides new information about E2 regulation of genes in BCAA metabolism and expression of adipogenesis-associated medag in human SGBS preadipocytes during their differentiation.