FACS-based Phenotype Analysis of White Blood Cells : Interplay with Lynch Syndrome Related Circulating Micro-RNAs

Abstract

DNA:n korjausgeenien mutaatiosta aiheutuva Lynchin syndrooma (LS) on perinnöllinen syöpien kehittymiselle altistava sairaus. LS kantajien syöpäriskiin vaikuttavia tekijöitä ei vielä ole kunnolla tutkittu. Epigeneettisten tekijöiden, kuten ei-koodaavien verenkierron mikro-RNA:den (cmiR), jotka säätelevät geenien ilmenemistä, on kuitenkin todettu vaikuttavan syöpäriskiin. Tutkimuksissa on havaittu tiettyjen cmiR:iden ilmenemistasojen poikkeavan LS:n kantajilla verrattuna terveisiin ei-kantajiin. LS kantajien cmiR tasot olivat hyvin samankaltaiset kolorektaalisyöpäpotilailta tutkittujen cmiR tasojen kanssa, mikä viittaa siihen, että löydetyt miR:t voisivat vaikuttaa syövän kehittymiseen tai torjuntaan. Koska valkosolut toimivat syövän torjunnassa, on mahdollista, että nämä LS:ssa poikkeavissa määrin ilmenevät verenkierron miR:t (LS cmiR:t) vaikuttaisivatkin syöpäriskiin valkosolujen kautta. Tämän työn tarkoituksena oli kehittää menetelmä cmiR:iden ilmentymismäärien tutkimiseen erityyppisissä valkosoluissa, ja siten tarkastella ilmentävätkö valkosolut myös LS cmiR:ita. Tätä varten terveiltä ihmisiltä otetuista verinäytteistä eristettiin valkosolut ja ne lajiteltiin tyypeittäin erillisiksi solupopulaatioiksi virtaussytometrilla. Solujen miR:t eristettiin ja qPCR:n avulla tutkittiin sisälsivätkö näytteet seuraavia LS cmiR:ita: miR-339-5p, let-7e-5p, miR-451a, miR-320a ja miR-15a-5p. Tulokset osoittivat, että valkosolut ilmensivät kaikkia edellä mainituista cmiR:ista. miR-320a tasot olivat lisäksi huomattavia eri valkosolutyypeissä, erityisesti neutrofiileissä. Tämä voisi viitata siihen, että miR-320a säätelisi neutrofiilien toimintaa. Lisäksi työssä tutkittiin vaikuttaako miR-15a-5p syövän kehitykseen yhdistetyn ja tulehdusta aiheuttavan viestiaineen, interleukiini-1β:n (IL-1β) säätelyyn. miR-15a-5p:tä siirrettiin viljeltyihin ihmisen valkosoluihin, IL-1β:n tuotto käynnistettiin lisäämällä viljelmiin lipopolysakkaridia ja IL-1β:n geenien ilmentymistasoja valkosoluissa tutkittiin qPCR:lla. Selkeää muutosta IL-1β:n ilmenemisessä miR-15a-5p sisältävissä soluissa verrattuna kyseistä cmiR:ta sisältämättömiin soluihin ei kuitenkaan havaittu. Tutkimus osoitti kehitettyjen menetelmien kuitenkin olevan toimivia samankaltaisiin tutkimustarkoituksiin osoittaen valksolujen ja LS cmiR:iden välisen yhteyden ja sen tarkemman tutkimisen tärkeyden tulevaisuudessa.

Lynch Syndrome (LS), caused by mutations in DNA mismatch repair genes, is an inherited cancer predisposition increasing the risk of developing cancer already at young age. Factors affecting the cancer risk in LS are still understudied. Epigenetic factors such as circulating micro-RNAs (cmiRs) – non-coding RNAs that epigenetically regulate gene expression and travel in blood – have been described to affect that risk. It has been demonstrated that cancer free LS carriers have distinct cmiR profiles from healthy individuals but share similarities with colorectal cancer patients. As white blood cells, also referred as leukocytes, participate in cancer prevention it could be possible that these differentially expressed cmiRs affect cancer risk and development through leukocytes. The aims of this thesis were to develop a method for studying miR expression in different leukocyte types and for examining whether miR-15a-5p would regulate gene expression of inflammation promoting and possibly cancer associated molecule interleukin-1β in leukocytes. For the first aim leukocytes were extracted from the human blood of healthy individuals, and different leukocyte types sorted with a flow cytometer. The miRs were then extracted from sorted subpopulations and expression levels of miR-339-5p, let-7e-5p, miR-451a, miR-320a and miR-15a-5p studied with qPCR. Results revealed that leukocytes expressed all of these cmiRs. miR-320a showed significant expression in all leukocyte subtypes. Especially neutrophils showed prominent miR-320a expression suggesting it could have significance in neutrophil functions related regulation. For the second aim, miR-15a-5p was transfected into human leukocyte culture and production of interleukin-1β triggered with lipopolysaccharides. Gene expression levels of interleukin-1β in miR transfected and non-transfected cultures were examined with qPCR, but clear difference was not detected. Results indicated that more repetitions are required for better evaluation. Nevertheless, the designed protocols proved functional for the purposes and this study strengthened the connection between cmiRs and leukocytes indicating importance for further investigations.