IHN- ja VHS-virusten RT-qPCR-testimenetelmän käyttöönotto sekä konsentrointimenetelmien vertailu

Abstract

Kiertovesiviljely (RAS) on vedenkäytöltään tehokas ja ekologinen kalanviljelymenetelmä, joka mahdollistaa vesiviljelyn myös alueilla, joissa veden saatavuus on rajallista. Kalojen patogeenit aiheuttavat kuitenkin haasteita vesiviljelyssä, erityisesti virukset, kuten IHNV (tarttuva vertamuodostavan kudoksen kuolio -virus) ja VHSV (virusperäinen verenvuotoseptikemia -virus), joita vastaan ei ole hoitoa tai rokotetta. Kiertovesilaitokseen päätyessään virus voi levitä nopeasti koko laitokseen, jolloin tyhjennettävän ja desinfioitavan laitoksen kokemat tappiot ovat merkittävät. Nykyiset testimenetelmät eivät aina tunnista piilevää infektiota, minkä vuoksi säännöllinen tuontikalojen ja -mädin testaaminen on tärkeää virusten leviämisen estämiseksi. Tässä työssä optimoitiin RT-qPCR-testimenetelmää (kvantitatiivinen käänteiskopiointipolymeraasi-ketjureaktio) IHN- ja VHS-virusten havainnointiin ja vertailtiin virusten konsentrointimenetelmiä. Työssä tarkasteltiin myös positiivisen kontrollin lisäämistä RT-qPCR-reaktioon (multiplex-PCR), sillä kliinisessä testauksessa menetelmää käytetään usein varmistamaan testin toimivuus. Työssä testattiin ultrasuodatusta, polyetyleeniglykolisaostusta (PEG-saostus), kylmäkuivausta ja InnuPrep-helmiä, jotka on valmistettu vettä sitovasta polymeeristä. Lisäksi tarkasteltiin IHNV-infektoituneesta RAS-laitoksesta otettuja vesinäytteitä ja kokeiltiin kehitetyn testin toimivuutta näytteillä. RT-qPCR-testistä saatiin tarkka, ja testillä pystyttiin havaitsemaan 400 µl:n näytteestä noin kolme viruspartikkelia. Konsentrointimenetelmistä PEG-saostus ja ultrasuodatus kasvattivat näytteen konsentraatiota hieman, ja ultrasuodatus valittiin menetelmän nopeuden ja yksinkertaisuuden vuoksi RAS-laitokselta saatujen näytteiden käsittelyyn. Kumpikaan menetelmistä ei kuitenkaan kasvattanut näytteen konsentraatiota merkitsevästi. Kahdessa RAS-laitokselta saadussa vesinäytteessä havaittiin pieniä määriä IHN-virusta, mutta testituloksen varmistamiseksi PCR-tuote olisi tullut sekvensoida. Loput seitsemän näytettä olivat negatiivisia viruksen suhteen. Ultrasuodatuksen konsentrointitehokkuutta tarkasteltiin kalan RNA:n kautta RAS-näytteistä, jolloin pitoisuutta onnistuttiin kasvattamaan jopa 31-kertaiseksi. Työn tuloksia voidaan mahdollisesti hyödyntää testaamisen nopeuttamisessa kalanviljelylaitoksilla, sillä kehitetty testi kaikkine vaiheineen vaatii vain noin kuusi tuntia. Tämä on huomattavasti tällä hetkellä käytössä olevaa soluviljelytestiä nopeampi, jonka tulosten saamiseen saattaa kulua jopa 14 vuorokautta.

Recirculating aquaculture system (RAS) is an ecologically sustainable method of fish farming, and it can be used in a variety of environments, even in places that lack water. Aquatic viral pathogens, such as diseases IHNV (infectious hematopoietic necrosis virus) and VHSV (viral hemorrhagic septicemia virus), threaten fish farming, because there are no vaccines or treatments against them. Viral pathogens can spread rather fast to the whole facility, in which case the entire facility has to be sanitized. This causes major economic losses to the facility. The way to prevent the spread of fish diseases IHN and VHS is the recurrent testing of fish fry and eggs before they are transported to facilities, but the current test methods are not fast enough for this kind of testing. This work optimized the RT-qPCR (quantitative reverse-transcript polymerase chain reaction) testing method for detecting IHN and VHS viruses and investigated four different virus concentration methods. In the study, the addition of a positive control to the RT-qPCR reaction (multiplex-PCR) was also investigated, as in clinical testing, this method is often used to verify the functionality of the test. Ultrafiltration, polyethylene glycol (PEG) precipitation, freeze-drying, and InnuPrep beads, which are made from a water-absorbing polymer, were the concentration methods tested in this work. In addition, water samples were taken from an IHNV-infected RAS facility, and the performance of the developed test was tested on the samples. The RT-qPCR test was accurate and could detect concentrations as little as three viral particles from a 400 µl sample. Among the concentration methods, PEG precipitation and ultrafiltration slightly increased the concentration of the sample, but ultrafiltration was selected for processing samples from the RAS facility due to its speed and simplicity. Neither of these methods had a significant effect on the concentration of the sample. Small amounts of IHN virus were detected in two out of nine water samples from RAS facility, but test results were not confirmed properly with sequencing. Samples from the RAS-facility were ultrafiltrated, and the concentration of the fish RNA in the sample was increased up to 31-fold. The results of this work could be used to improve testing at fish farming facilities, as the test developed in the work can be done in six hours, which is significantly less than the currently used testing method, which can take up to 14 days.