Role of serine synthesis pathway parallel to glycolysis in C2C12 muscle cell proliferation and myotube hypertrophy potential : effect of phosphoglycerate dehydrogenase inhibition

Abstract

Pro-gradu tutkimuksen tarkoituksena on tuoda lisätietoa glykolyysin rinnakkaisen aineenvaihduntareitin, seriinisynteesin, roolista C2C12 lihassolujen jakaantumis- hypertrofia potentiaaliin. Potentiaalin muutoksia tarkastellaan estämällä kemiallisesti seriinisynteesin toimintaa. Samalla seurataan 14C isotoopin kulkeutumista seriinisynteesireitissä muodostuneisiin biomolekyyleihin. Lisäksi tutkitaan, aiheuttaako kemialliset inhibiittorit NCT- 503 ja CBR-5884 samankaltaisia vaikutuksia. Lopuksi tarkastellaan, muuttuuko glukoosin käyttö biomolekyylien valmistamisessa. Seriini synteesi aineenvaihduntareitin on havaittu olevan merkittävä solun kasvun ja jakautumisen kannalta. Sen on havaittu olevan merkittävä lähtöaine muiden biomolekyylien esiasteiden valmistamisessa. Kirjallisuutta aineenvaihduntareitin roolista lihassolun jakautumisen ja koon kasvun näkökulmasta on vähäisesti. Täten seriini synteesi aineenvaihduntareitin tutkiminen lihassoluissa tuottaa mahdollisesti lisätietoa seriinisynteesin roolista lihassolun jakautumisen ja hypertrofia potentiaalin näkökulmasta. Ihmiskehossa on keskimäärin 40 % lihaskudosta. Lihaskudoksella on tärkeä rooli aineenvaihdunnallisessa terveydessä. Lihasmassa toimii niin aminohappo- kuin glykogeeni varastona. Lisäksi lihaskudos on yksi tärkeimmistä glukoositasapainon säätelijöistä. 1900- luvun alussa Warburg havaitsi, että jakaantuvat solut lisäävät glukoosin kulutusta myös aerobisissa olosuhteissa. Ilmiö nimettiin Warburgin efektiksi. On ehdotettu, että lisääntynyt glukoosin käyttö soluissa edistäisi solun jakautumista sekä kasvua tuottamalla aineenvaihduntatuotteita. Yksi merkittävimmistä aineenvaihduntareiteistä on seriinisynteesi, joka tuottaa aminohappo seriiniä. Seriiniä voidaan käyttää proteiinien, RNA:n sekä lipidien valmistamisen esiasteena. Seriinisynteesireitin entsyymi fosfoglyseraatti dehydrogenaasi, PHGDH, muuttaa glykolyysin välituotteen 3-fosfoglyseraatin 3-fosfohydroksipyruvaatiksi, josta se edelleen muokataan seriiniksi. PHGDH entsyymin manipulaatio voidaan suorittaa entsyymin toimintaa heikentävillä yhdisteillä kuten NCT-503:lla sekä CBR-5884:lla. Muutoksia lihassolun jakautumisen ja hypertrofian potentiaalissa PHGDHn manipulaation seurauksena tutkitaan 14C isotooppileimauskokeilla. 14C kerääntymistä makromolekyyleihin seurataan. Solukokeissa soluille annetaan leimattua glukoosia tai valiinia ja osalle soluista lisätään kemiallinen käsittely heikentäen PHGDH:n toimintaa. Tuloksia verrataan eristämällä ei-käsitellyistä ja käsitellyistä soluista biomolekyylit ja mitataan kokonaisradioaktiivisuus jokaisessa makromolekyyli näytteessä. Mitä vähemmän on kokonaisradioaktiivisuutta, sitä vähemmän leimattua glukoosia on käytetty makromolekyylien valmistamisessa. Seriini synteesi aineenvaihdunta reitin kemiallinen heikennys NCT-503 sekä CBR-5884 yhdisteellä heikensi selkeästi lihassoli jakautumis- ja hypertrofiapotentiaalia. Kemiallinen käsittely vähensi 14C hiilien kertymisen leimatusta glukoosista proteiineihin, RNA:han sekä lipideihin verrattuna ei-käsitellyistä soluista eristettyihin makromolekyyleihin. Tällöin lihassolu ei voi tehokkaasti valmistaa solun jakautumiseen vaadittavia makromolekyylejä. Valtaosa leimatusta hiilestä glukoosista päätyi proteiineihin, jolloin glukoosin rooli tulosten perusteella voi olla suuri aminohappojen valmistamisessa vahvistaen aminohappojen roolia lihassolujen jakautumisessa sekä kasvussa. Glukoosin osuus makromolekyylien valmistamisessa havaittiin vaihtelevan. Tämä voidaan havaita siinä, kuinka voimakas 14C kokonaisradioaktiivisuus vähenee makromolekyyleissä kemiallisen käsittelyn seurauksena. Suurempi väheneminen on mahdollisesti yhteydessä suurempaan glukoosin rooliin. Lisäksi inhibiittoreilla esiintyy potentiaalisesti vaikutuseroja.

The purpose of the thesis is to elaborate the role of serine synthesis pathway, a metabolic pathway parallel to glycolysis, in the potential of C2C12 muscle cells to proliferate and grow. Changes in potential are examined by chemically inhibiting the activity of serine synthesis pathway. At the same time, the net incorporation of the 14C isotope to the biomolecules formed in the serine synthesis pathway is examined. In addition, it is investigated whether the chemical inhibitors NCT-503 and CBR-5884 have similar inhibition effects to biomolecule synthesis. Finally, the changes in utilization of glucose in the synthesis of biomolecules are examined. The serine synthesis pathway has been found to be important for cell growth and division. Serine synthesis pathway has been found to be a significant contributor in formation of precursor molecules for synthesis of other biomolecules. The literature on the role of the pathway in muscle cell division and growth is sparce. Thus, examining aforementioned pathway in muscle cells potentially yields valuable information about its role in muscle cell division and hypertrophy potential. The human body has an average of 40% muscle tissue. Muscle tissue plays an important role in metabolic health. Muscle mass acts as both amino acid and glycogen storage. In addition, muscle tissue is one of the most important regulators of glucose balance. At the beginning of the 20th century, Warburg discovered that dividing cells increase glucose consumption even under aerobic conditions. The phenomenon was named as the Warburg effect. It has been suggested that the increased use of glucose in cells would promote cell division and growth by producing metabolic byproducts. One of the most significant metabolic pathways is serine synthesis, which produces the amino acid serine. Serine can be used as a precursor for the production of proteins, RNA and lipids. The serine synthesis pathway enzyme phosphoglycerate dehydrogenase, PHGDH, converts the glycolysis intermediate 3- phosphoglycerate into 3-phosphohydroxypyruvate, from which it is further modified into serine. Manipulation of the PHGDH enzyme can be performed with compounds that weaken the activity of the enzyme, such as NCT-503 and CBR-5884. Changes in muscle cell division and hypertrophy potential as a result of PHGDH manipulation are investigated with 14C isotope labeling experiments. 14C accumulation in macromolecules is monitored. In cell experiments, the cells are given labeled glucose or valine and chemical treatment is added to some of the cells, weakening the function of PHGDH. The results are compared by isolating biomolecules from untreated and treated cells and measuring the total radioactivity in each macromolecule sample. The less total radioactivity there is, the less labeled glucose has been used to make the macromolecules. The chemical weakening of the serine synthesis pathway with the compound NCT-503 and CBR-5884 clearly weakened the muscle cell division and hypertrophy potential. Chemical treatment reduced the accumulation of 14C carbons from labeled glucose to proteins, RNA and lipids compared to macromolecules isolated from untreated cells. In this case, the muscle cell cannot efficiently produce the macromolecules required for cell division. Most of the labeled carbon glucose ended up in proteins, so based on the results, the role of glucose may be considered significant in the production of amino acids, highlighting the role of amino acids in the division and growth of muscle cells. The utilization of glucose in the production of macromolecules was found to vary. This can be observed in how noticeable the total 14C radioactivity decreases in macromolecules as a result of chemical treatment. The greater reduction may be associated to a greater role of glucose in biomolecule synthesis. In addition, there are potentially differences in effects with inhibitors.