Structural insight of PP2A inhibitor proteins and their interaction with PP2A Aand B56-subunits

Abstract

Protein phosphatase 2A (PP2A), the principal Serine/Threonine phosphatase, functions as a tumor suppressor. In most of the cancers, the PP2A tumor suppressor activity is inhibited either genetically or by the overexpression of PP2A inhibitor proteins. It is therapeutically tempting idea to reactivate inhibited PP2A by small molecule modulators, For that, a better understanding of the structural and molecular framework of PP2A inhibition is required. In this study, we have characterized the structural properties of PP2A inhibitor proteins ARPP- 19, ARPP-16, and ENSA, and their interaction with A- and B56-subunits of PP2A by combining NMR spectroscopy with SAXS and microscale thermophoresis. The results reveal that both ENSA and ARPP proteins are intrinsically disordered, but not completely random coil as they have three regions having the propensity to form transient α-helical structures. Both ARPPs and ENSA were observed to interact with PP2A A-subunit with modest affinity, whereas, the interaction with B56-subunit is weak and transient. When ARPP and ENSA proteins are phosphorylated by Gwl/MAST3 kinase they inhibit PP2A during mitosis. The phosphomimetic mutants resembling phosphorylation of ARPPs showed increased affinity towards both A- and B56- subunits, while the corresponding phosphomimetic mutants of ENSA failed to bind to all other B56 subunits except B56α. Two distinct interaction modes of ARPPs and ENSA with the PP2A A-subunit were identified. In ARPPs, a second transient α-helix including its flanking region forms an A-subunit binding motif, whereas ENSA interacts with A-subunit using an extended region comprising all three transient α-helical regions. Together, these studies suggest that intrinsically disordered ARPPs and ENSA bind to PP2A transiently using preformed structural elements. Altogether, our results provide a crucial step towards the understanding the molecular bases behind PP2A inhibition, which provide a foundation for the development of novel and clinically feasible PP2A targeted therapies. Keywords: ARPP-16/ARPP-19; ENSA; Intrinsically Disordered proteins; NMR, Protein Phosphatase 2A, SAXS.

Proteiinifosfataasi 2A (PP2A) on merkittävä kasvunrajoittimena toimiva Seriini/Treoniini-fosfataasi. Monissa syöpätyypeissä PP2A:n kasvunrajoitinaktiivisuus on estetty joko geneettisesti tai PP2A:n toiminnan estävien proteiinien avulla. Terapeuttisesti on houkuttelevaa uudelleen aktivoida PP2A estämällä inhibiittori proteiinien toiminta pienmolekyyleillä. Tätä varten on kuitenkin oleellista ymmärtää PP2A:n toiminnan estävien inhibiittoriproteiinien molekulaarinen ja rakenteellinen mekanismi. Tässä tutkimuksessa olemme karakterisoineet PP2A:n inhibiittoriproteiinien ARPP-19, ARPP-16 ja ENSA rakenteellisia ominaisuuksia sekä näiden vuorovaikutusmekanismia PP2A:n A- ja B56-alayksiköiden kanssa yhdistämällä NMR-spektroskopiaa, SAXS:a ja mikroskaalan termoforeesia. Tutkimuksista saadut tulokset osoittavat, että sekä ARPP-että ENSA-proteiinit ovat luontaisesti rakenteettomia proteiineja, mutta näillä proteiineilla on kuitenkin taipumus muodostaa hetkellisesti α-kierteitä. Sekä ARPP-ja ENSA-proteiinien havaittiin sitoutuvan PP2A:n A-alayksikköön kohtalaisen vahvasti, kun taas sitoutuminen B56-alayksiköihin on heikompaa. Gwl/MAST3-kinaasien fosforyloima ARPP-19 ja ARPP-16 estävät PP2A:n toiminnan mitoosin aikana. Gwl/MAST3- kinaasien fosforylointia matkivien mutaatioiden havaittiin kasvattavan ARPP-19- ja ARPP-16 affiniteettia sekä A- että B56-alayksiköihin. Vastaavat mutaatiot ENSAproteiinissa sen sijaan esti sitoutumisen kaikkiin muihin B56-alayksiköhin paitsi B56α-alayksikköön. ARPP-ja ENSA-proteiinien havaittiin sitoutuvan PP2A A-alayksikköön eri tavoilla. ARPP-proteiini käyttää sitoutumisessa toista α-kierrettä sekä tämän viereisiä aminohappoja. ENSA proteiini puolestaan hyödyntää sitoutuessaan kaikkia kolmea hetkellisesti muodostuvaa α-kierrettä. Nämä tulokset yhdessä osoittavat, että rakenteettomat ARPP-ja ENSA-proteiinit sitoutuvat PP2Aproteiiniin käyttäen ennalta muodostuneita rakenteellisia alueita. Yhteenvetona voidaan todeta, että meidän tutkimusten tulokset antavat oleellista tietoa, joka auttaa kehittämään uusia ja kliinisesti käyttökelpoista PP2A-proteiiniin kohdennettuja lääkehoitoja. Avainsanat: ARPP-16/ARPP19; ENSA; luontaisesti epäjärjestäytynyneet proteiinit, NMR, Proteiinifosfataasi 2A, SAXS.