Determining the substrate specificity of two lysostaphin enzyme family members using NMR spectroscopy

Abstract

Yksi merkittävimmistä ihmisen patogeeneista on Staphylococcus aureus-bakteeri. Se aiheuttaa erityyppisiä vakavia infektioita kuten verenmyrkytystä ja sydämen sisäkalvon tulehdusta, sekä lievempiä ihotulehduksia ja ruokamyrkytystä. Tällä hetkellä S. aureus-infektioita hoidetaan beetalaktaami-antibiooteilla (esim. penisilliinillä), mutta antibioottiresistenttien bakteerikantojen kuten MRSA:n yleistymisen vuoksi, on S. aureus-infektioiden hoito erittäin hankalaa. Siksi tarve uudentyyppisille stafylokokki-infektioita hoitaville lääkeaineille onkin kova. Bakteerien soluseinämää pilkkovat entsyymit – peptidoglykaanihydrolaasit – ovat eräs lupaavimmista uudentyyppisistä antistafylokokkaalisista lääkeaineista. Kuten muillakin gram-positiivisilla bakteereilla, S. aureuksella on paksu bakteerisolua suojaava peptidoglykaani-seinämä. Peptidoglykaanihydrolaasit ovat entsyymejä, jotka pilkkovat tiettyjä kemiallisia sidoksia tässä soluseinämässä, aiheuttaen siten bakteerisolun tuhoutumisen. Peptidoglykaanihydrolaasien keskeisimmät hyödyt ovat niiden (1) spesifisyys, sillä entsyymit toimivat kohdennetusti pilkkoen juuri tiettyjä kemiallisia rakenteita bakteerin peptidoglykaani-soluseinämässä, (2) matala myrkyllisyys, (3) entsyymien suhteellisen helppo ja tehokas tuotto, (4) niiden kyky tuhota sekä aktiivisia että inaktiivisia bakteerisoluja ja toimia myös biofilmeissä, sekä lopuksi (5) entsyymien käyttö antibioottien kanssa yhdistelmähoitona. Tässä tutkielmassa tarkastellaan erilaisten synteettisten peptidoglykaanifragmenttien pilkkoutumista kahden peptidoglykaani hydrolaasin toimesta. Tutkittavat entsyymit kuuluvat lysostafiini-entsyymiperheeseen. Entsyymien tehokkuutta erilaisten peptidoglykaanifragmenttien katalyysissä tutkittiin käyttäen liuostilan 1D 1H ydinmagneettista resonanssispektroskopiaa (NMR), joka mahdollistaa hydrolyysireaktioiden reaaliaikaisen seurannan atomiresoluution tasolla. Reaktiotuotteiden rakenteet määritettiin 2D NMR -spektroskopialla. Kummallekin tutkittavista entsyymeistä löydettiin uusia substraatteja eli bakteerien peptidoglykaanirakenteita, joita ne pilkkovat kohdennetusti. Lisäksi peptidoglykaanin entsymaattisesta pilkkoutumisreaktiosta saatiin tarkempaa tietoa, joka mahdollistaa entsyymien modifikaation tulevaisuudessa, ja siten antistafylokokkaalisten lääkeaineiden kehityksen.