Unraveling the pleomorphic forms of Borrelia burgdorferi

Abstract

Borrelia burgdorferi bakteeri on puutiaisten välittämän borrelioosin taudinaiheuttaja. Tämä tavanomaisesti spirokeettana esiintyvä bakteeri kykenee vaihtamaan muotoaan ympäristöolosuhteiden muuttuessa epäsuotuisiksi. Borrelia-bakteerin eri esiintymismuotojen uskotaan olevan borrelioosin pitkittyneen taudinkuvan takana, minkä vuoksi näiden muotojen tutkiminen on tärkeää. Tämän pro gradu –työn tavoitteena oli tutkia B. burgdorferin pleomorfisia muotoja ja löytää muotoja erottavia morfologisia tekijöitä sekä eroja proteiiniekspressiossa ja borrelioosipotilasseerumivasteessa spirokeettojen ja pyöreän esiintymismuodon välillä. Olettamuksena oli, että konfokaalimikroskopialla muotojen väliltä löydetään rakenteellisia eroja lipidi- ja hiilihydraattiarkkitehtuurissa. Myös proteiiniekspression ja borrelioosipotilaiden seerumivasteen oletettiin olevan yksilöllinen kullekin muodolle. Kollageeniin sitoutuva Acid Fuchsin –väri värjäsi ainoastaan biofilmejä, kun taas N-asetyyliglukosamiineihin sitoutuva WGA-väri (Wheat Germ Agglutinin) tarttui vain vedellä aikaansaadun pyöreän esiintymismuodon (round body) pinnalle. WGA-värjäyksen tulos viittaa peptidoglykaanin paljastumiseen bakteerin ulkopinnalla pyöreässä esiintymismuodossa. Läpäisyelektronimikroskooppikuvista koottiin kuvasarja mallintamaan spirokeetan laskostumista pyöreään esiintymismuotoon. Lisäksi näistä kuvista tarkasteltiin kaksoiskalvorakenteen ja flagellojen säilymistä pyöreässä esiintymismuodossa ja havaittiin neljän päivän inkuboinnin ihmisen seerumissa aiheuttavan muodon muutoksen pyöreään esiintymismuotoon. Lisäksi ihmisen seerumin havaittiin aiheuttavan runsasta vesikkelien eritystä sekä protoplasmisen sylinterin turpoamista. Flagellan säilyminen pyöreässä esiintymismuodossa todettiin lisäksi immunoleimaamalla flagella p41 -vasta-aineella. Flagellan säilyminen ja vesikkeleiden eritys viittaavat siihen, että pyöreä esiintymismuoto kykenee aiheuttamaan immuunivasteen. Lisäksi WGA-värjäys todisti ainakin toisen soluseinän pääkomponentin, N-asetyyliglukosamiinien, esiintymisen myös pyöreässä esiintymismuodossa. Näin ollen tulokset haastavat olettamuksen, että pyöreä esiintymismuoto olisi soluseinätön. Spirokeettojen ja pyöreän esiintymismuodon proteiiniprofiileja verrattiin keskenään kaksiulotteisella geelielektroforeesilla, eikä pyöreän esiintymismuodon proteiinimäärän havaittu olevan pienempi kuin spirokeettojen, mitä olisi voitu olettaa mikäli ulkokalvo olisi vahingoittunut. Sen sijaan havaittiin useiden 15-40 kDa proteiinien ekspression olevan suurempi pyöreässä esiintymismuodossa. Spirokeettojen ja pyöreiden esiintymismuotojen antigeenisyyttä vertailtiin borrelioosipotilasseerumien avulla. Vasta-aineet näyttivät vaihtelevan voimakkaasti seerumien välillä. Kuitenkin muodot aiheuttivat selkeästi erotettavat, yksilölliset immuunivasteet, mikä viittaa myös pyöreän esiintymismuodon olevan kliinisesti merkittävä muoto. Useat kokeessa käytetyistä seerumeista näyttivät reagoivan voimakkaammin pyöreän esiintymismuodon proteiinien kanssa. Näiden kokeiden pohjalta on mahdollista jatkaa työvälineiden valmistelua B. burgdorferin eri esiintymismuotojen yksilölliseksi tunnistamiseksi, mikä voisi parantaa bakteerin havainnointia borrelioositesteissä.

Lyme disease is caused by Borrelia burgdorferi bacteria and typically diagnosed by an erythema migrans rash. As the disease develops it becomes more challenging to diagnose. Pleomorphic forms might be responsible for the prolonged disease profile, even though much controversy exists about them. Thereby the aim of this study was to examine the pleomorphism of B. burgdorferi. The hypothesis is that each pleomorphic form has specific morphological traits and unique antigenicity. Protein expression is also different in spirochetes and round bodies (RBs). The collagen dye Acid Fuchsin stained only biofilms whereas N-acetyl glucosamine dye wheat-germ agglutinin (WGA) stained RBs. WGA staining illustrated that one of the main components of bacterial cell wall, N-acetyl glucosamines, are still present in RBs and indicated that peptidoglycan would become exposed at the surface of RBs. Human serum induced RB formation suggesting that this form has physiological significance. Transmission electron microscope (TEM) images lead to a model demonstrating how the spirochetes could fold into RBs. The presence of flagella in the RBs was examined by immunolabeling with flagellar antibody p41. TEM images of human serum induced RBs revealed increased vesicle formation and swelling of protoplasmic cylinders. Undamaged phospholipid bilayers were observed in RB TEM images. In addition, protein profiles of spirochetes and H2O RBs were analyzed with two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D PAGE). Analysis of the protein profiles did not reveal a decrease in the overall protein expression of RBs, which might have been expected if this form would have a damaged outer cell wall. Instead, an increase of the expression of several proteins of molecular weight 15-40 kDa was observed in the RBs. These proteins might be needed for adjusting to the unfavorable environmental conditions. Antigenicity of spirochetes and RBs were compared by western blots immunolabeled with Lyme patient sera. The blots demonstrated that RBs could induce an immune response. Moreover, the immune response is different from spirochetes. However, the antigen-antibody response seemed to vary greatly depending on the serum. Still, RBs could be clinically important since their antigenicity differs from the parent spirochete form. These findings could provide tools for the specific detection of pleomorphic forms of B. burgdorferi benefiting the diagnosis of Lyme disease.