Monomerisaation vaikutus Deinococcus radioduransin fytokromiin

Abstract

Fytokromit ovat yksi kolmesta fotomorfogeneesiä säätelevistä proteiiniperheistä. Niitä löytyy kasveista, bakteereista ja sienistä. Fytokromit reagoivat ympäristön muuttuviin valaistusolosuhteisiin, ja niiden tehtäviin kuuluvat muun muassa kasveilla siementen kehittymisen ja bakteereilla solusyklin säätely. Luonnossa fytokromi esiintyy homodimeerinä. Fytokromin perusrakenne koostuu kromoforin sisältävästä fotoreseptorialueesta sekä signalointialueesta, joka välittää tiedon valaistusolosuhteiden muuttumisesta solussa eteenpäin. Tässä tutkielmassa käytetyn Deinococcus radiodurans -bakteerin bakteerifytokromin fotoreseptorialueen runko rakentuu Per/Arndt/Sim (PAS) ja cGMP fosfodiesteraasi/adenyylisyklaasi/FhlA (GAF) -domeeneista, jotka muodostavat yhdessä kromoforin sitoutumistaskun sisältävän domeenin (cromophore binding domain, CBD). CBD:iin on kiinnittynyt tetrapyrroli biliverdiini. Fotoreseptorialueeseen kuuluu lisäksi fytokromiin liittyvä domeeni (phytochrome-specific domain, PHY), joka on kiinnittynyt GAF-osaan. Fotoreseptorialue on puolestaan liittynyt histidiinikinaasina toimivaan signalointialueeseen. Fytokromi toimii luonnossa kytkimenä, jolla on lepotila Pr ja valottunut tila Pfr. Valottuminen tapahtuu, kun Pr-tilaisen fytokromin tetrapyrroli absorboi punaista valoa. Tämän seurauksena tetrapyrrolin muoto muuttuu vaikuttaen samalla koko fytokromin laskostumiseen. Pfr-tilasta fytokromi palautuu takaisin Pr-tilaan joko absorboimalla pitempiä aallonpituuksia tai spontaanisti pimeäpalautumiseksi kutsutussa reaktiossa. Tutkimuksessa pyrittiin selvittämään vaikuttavatko monomerisaatio ja PHY-domeenin lisääminen CBD:n fysikaalisiin ja spektroskopisiin ominaisuuksiin. Tutkimusta varten tuotettiin sekä CBD:n että CBD-PHY:n dimeeri- ja monomeerimuotoa. Fytokromikonstruktit analysoitiin korkean erottelun nestekromatografia-kokoa erotteleva kromatografia -mittauksilla sekä UV-VIS -spektroskopialla. Saaduista tuloksista on havaittavissa, että CBD:n dimeeri- ja monomeerimuotojen välillä on merkittäviä fysikaalisia eroja. Korkean erottelun nestekromatografia-kokoa erotteleva kromatografia -mittausten tuloksista voidaan todeta, että monomeerimuodon laskostuminen Pfr -tilassa on mahdollisesti joustavampi kuin dimeerimuodon. Myös monomeerimuodon spektroskooppiset ominaisuudet poikkeavat dimeerimuodon ominaisuuksista. Monomeerimuoto valottuu dimeerimuotoa täydellisemmin Pfr-tilaan, ja pimeäpalautuminen on huomattavasti hitaampaa. PHY -domeenin lisäys CBD:iin muuttaa fytokromin spektroskopisia ominaisuuksia että stabiiliutta. CBD-PHY:n dimeeri- ja monomeerimuodot valottuivat CBD:tä paremmin Pfr-tilaan, ja etenkin monomeerimuodon pimeäpalautuminen on lähes täysin estynyt. Saadut tulokset osoittavat PHY -domeenin olevan kriittinen tekijä CBD:n stabiloinnissa. PHY-domeenin liittäminen CBD:n mahdollistaa viritystilan säilyttämisen, joka on tärkeää tutkittaessa mahdollisia käytännön sovelluksia. Esimerkki mahdollisista käytännön sovelluksista voisi olla punaisella aallonpituudella fluoresoivan proteiinin tuottaminen. Myös monomerisaatiolla on tärkeä rooli CBD:n eri konstruktien spektroskooppisessa käyttäytymisessä ja näin ollen voisi olla järkevää painottaa CBD:n monomeerikonstruktien tutkimusta.

Phytochromes are one of the three protein families regulating photomorphogenesis. They are found in plants, bacteria, cyanobacteria and fungi. Phytochromes react to changes in environment´s light conditions and for example they regulate seed germination and control of bacteria cell cycle. In nature phytochromes occur as homodimers. Phytochrome´s basic structure consists of cromophore-containing photoreseptor region and signaling region. The signaling region of the phytochrome reacts into alterations of light conditions and transmits information in the cell. The bacterial phytochrome of the Deinococcus radiodurans, which was used in this study, consists of the Per/Arndt/Sim (PAS) domain and the cGMP phosphoryesterase/adenylcyclase/FhlA (GAF) domain. Together PAS and GAF domains form the chromophore binding domain (CBD) and tetrapyrrole biliverdin is attached to CBD. Photoreceptor region is attached to a histidine kinase signaling region and contains also the phytochrome-related domain (PHY), which is linked to GAF. In nature phytochromes act like swithes having two excitation states: Pr and light-activated Pfr. Excitation occurs when tetrapyrrole in Pr form absorbs red wavelengths of light. This causes changes in tetrapyrroles conformation, which affects the folding of the phytochrome. Phytochrome can revert back to Pr by absorbing far-red wavelengths or spontaneously in dark reversion. The aim of this study was to examine whether monomerization and the addition of PHY domain affect the physical and spectroscopical properties of CBD. CBD and CBD-PHY were produced in both di- and monomer forms. High pressure liquid cromathography-size eclusion chromatography and UV-VIS spectroscopy were used to analyze phytochrome constructs. Results indicate that there are significant physical differences between dimer and monomer forms of CBD. High pressure liquid cromathography-size eclusion chromatography results indicate that the folding of the monomer form is more flexible compared to dimer form. Also, the spectroscopical properties of the monomer and dimer forms are different. In contrast to CBD dimer, the excitation of the CBD monomer is more complete and the dark reversion is prolonged. It was also discovered that the addition of PHY domain to CBD changes spectroscopical properties and stability of the protein. Light-activation of CBD-PHY was more complete compared to CBD in mono and dimer forms, and especially the dark reversion of the monomer form was almost completely inhibited. These results verify that addition of PHY domain is critical to stabilize CBD. Therefore, the addition of PHY domain enables preserving the excited state of the protein, which is consequential information in research of practical applications, for example in attempt to produce red-fluorescent protein. Also, due to spectroscopical effects caused by monomerization of CBD constructs, it is reasonable to emphasize the relevance to study CBD monomer constructs.