Fytokromi-spesifisen domeenin lisäkkeen vaikutus bakteerifytokromin valoaktivointiin : tuotto, puhdistus ja UV-Vis-spektroskopinen analyysi

Abstract

Fytokromit ovat punaista ja kaukopunaista valoa absorboivia valoreseptoreita, joita esiintyy kasveissa, bakteereissa ja sienissä. Fytokromiin sitoutunut molekyyli, kromofori, absorboi fotonin ja saa aikaan muutoksia fytokromin kolmiulotteisessa rakenteessa: punaista valoa absorboiva Pr-tila virittyy Pfr-tilaksi, joka palaa takaisin Pr-tilaan absorboimalla kaukopunaista valoa tai ilman valotusta pimeäpalautumalla. Fytokromin valovaihtuvuudessa tärkeän rakenteen on havaittu olevan fytokromi-spesifisessä domeenissa (PHY-domeenissa) sijaitseva PHY-lisäke. Tässä tutkielmassa pyrkimyksenä oli tuottaa ja puhdistaa Deinococcus radiodurans -bakteerifytokromia ilman PHY-lisäkettä ja verrata mutantin UV-Vis-spektriä villityypin spektriin. Lisäksi selvitettiin, saadaanko mutantti valotettua Pfr-tilaan. Mutanttia saatiin tuotettua ja puhdistettua pieni määrä, 0,51 mg. Mutantin valotus Pfr-tilaan onnistui. Mutantin ja villityypin UV-Vis-spektrit erosivat toisistaan, sillä mutantti absorboi villityyppiä vähemmän punaista ja kaukopunaista valoa. Pimeäpalautumisessa, jossa tarkasteltiin mutantin palautumista Pfr-tilasta takaisin Pr-tilaan ilman valotusta, havaittiin mutantin palautuvan huomattavasti nopeammin kuin villityypin. Tutkielman keskeinen päätelmä on, että PHY-lisäke voidaan poistaa fytokromista säilyttäen sen valovaihtuvuus. Mutantin UV-Vis-spektrin ja pimeäpalautumisen perusteella voidaan päätellä, että PHY-lisäke stabiloi Pfr-tilaa.

Phytochromes are photoreceptors, that absorb red and far-red light and are found in plants, bacteria and fungi. Chromophore, a molecule bound to phytochrome, absorbs a photon and causes changes in the three-dimensional structure of the phytochrome: the red light absorbing Pr state can be excited to the far-red light absorbing Pfr state. The phytochrome returns to the Pr state by the absorption of far-red light or thermally in dark. An important structure in photoactivation has been located to the phytochrome specific domain (PHY-domain) and the hairpin structure in the phytochrome specific domain. The aim of this thesis was to express and purify bacteriophytochrome of Deinococcus radiodurans without the hairpin structure and to compare the UV-Vis spectra of the mutant with the wild type. In addition, the aim was to find out if the mutant can be excited to the Pfr state. The expression of the mutant was successful and a small amount of phytochrome was purified, 0.51 mg. The mutant could be excited to the Pfr state. The UV-Vis spectra of the mutant and wild type phytochrome were different from one another: the mutant absorbed less red and far-red light than the wild type. In dark reversion experiment, where the kinetics of returning to Pr state from Pfr state was studied, it was observed that the mutant reversed faster than the wild type. The main conclusion is that the hairpin structure in the phytochrome specific domain can be removed while maintaining the ability of the phytochrome to be activated by light. Based on the UV-Vis spectra and the dark reversion, it is apparent that the Pfr state is stabilised by the hairpin structure of the phytochrome specific domain.