Echovirus 1 infektion vaikutus epidermaalisen kasvutekijäreseptorin endosytoosiin ja signalointiin

Abstract

Epidermaalinen kasvutekijäreseptori (EGFR) on yhdessä kollageeni- ja lamiinireseptori α2β1-integriinin kanssa tärkeä tekijä solun selviytymisen, kiinnittymisen ja jakautumisen säätelemisessä sekä syöpäsoluissa. Kasvutekijän sitoutumisen jälkeen EGFR:t dimerisoituvat, endosytoituvat klatriinivälitteisen endosytoosin kautta ja kulkeutuvat solun sisällä kolmen eri reitin mukaisesti: 1) EGFR-ligandi-kompleksi voi ubikitinaation seurauksena päätyä lysosomaaliseen pH:sta riippuvaan hajoitukseen, EGFR kierrättyy takaisin solukalvolle 2) ligandin irtoamisen tai 3) UBPY de-ubikitinaatioenstyymin toimesta. α2β1-integriinireseptori klusteroituu solukalvolle kiinnityttyään kollageeniin, lamiiniin, Echovirus1:een tai vasta-aineeseen ja endosytoituu ligandistaan riippuen joko klatriini- tai kaveoliini-lipidilauttavälitteisellä endosytoosilla. Proteiinikinaasi C:n (PKC) aktivaatio vaikuttaa sekä integriinin, että EGFR:n endosytoosissa. α2β1-integriinin endosytoosi on riippuvainen PKCα-aktivaatiosta. EGFR:lla threoniini 654:n fosforylaatio PKCα:n toimesta estää reseptorin ubikitinaation ja ohjaa sen kierrättävälle endosytoottiselle reitille. Aikaisempien tutkimuksiemme mukaan EGFR- ja α2β1-Integriiniendosomit kulkeutuvat solun sisällä hyvin lähellä toisiaan päätyen lopulta monivesikulaarisiin rakenteisiin. Reseptorit eivät kuitenkaan ole fyysisessä kontaktissa ja niiden vesikkelit ovat eri pH:ta. EGFR:n ja Integriinin välillä tiedetään kuitenkin olevan yhteyksiä ja α2β1-integriinin kautta tapahtuvan Echovirus1-infektion on havaittu vaikuttavan EGFR-hajotukseen. Tässä tutkimuksessa halusimme selvittää kuinka EV1-infektio vaikuttaa EGFR-säätelyyn. Keuhkosyöpäsolulinja A549:n EV1-infektoitujen ja infektoimattomien solujen lyso- tai proteosomaalinen hajotus estettiin bafilomysiiniA:lla, calpainilla tai bortezomibilla. PKCα:n vaikutusta tutkittaessa kinaasi aktivoitiin phorboli 12-myristaatti 13-asetaatilla. Käsiteltyjä soluja kuvattiin konfokaalimikroskoopilla joko pedattuina kaksiulotteisesti tai elävinä neliulotteisesti. Kvantitatiivinen kuvadata-analyysi tehtiin BioImageXD:llä. Kasvutekijällä aktivoituja A549-soluja kuvattiin myös transmissioelektronimikroskoopilla. Tuloksemme osoittivat että EGFR kulkeutui koeasetelmassamme samankaltaisten endosomaalisten rakenteiden kautta kuin EV1-α2β1-Integriinikompleksi. EV1-infektio vaikuttaa EGFR-kuljetukseen PKCα-aktivaatiota muistuttavalla tavalla: EGFR ohjautuu kierrättävälle endosytoosireitille ja sen hajotus heikkenee. Tuloksemme viittaavat EV1-infektion vaikuttavan EGFR:iin juuri PKCα-aktivaation kautta. EV1-α2β1-integriinikompleksin hajotuksen estyminen näytti myös lisäävän EGFR:n kertymistä solujen sisälle, joten viruksen vaikutus EGFR-reittiin välittyy vielä endosytoosin jälkeenkin. Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia aikaisemmin tehtyjen havaintojen kanssa, joiden mukaan α2β1-integriinin ja EGFR:n välillä on selvä, vaikkakaan ei fyysinen, vuorovaikutus. On hyvin mahdollista että EV1 hyötyy EGFR:-hajotuksen hidastamisesta. Virukselle on hyödyllistä pitkittää EGFR:n solunsisäistä signalointia, joka säätelee Ras-ERK-signalointisarjan kautta mitogeneesiä ja PI3-Akt-signalointireitin kautta johtaa anti-apoptoottiseen signalointiin. Molempien signalointireittien säätely mahdollistaa virukselle paremmat solunsisäiset replikaatio-olosuhteet.

Alongside with collagen and lamin receptor α2β1-Integrin, epidermal growth factor receptor (EGFR) is a crucial factor in cell survival, attachment, proliferation, mitosis and metastasis formation. Growth factor attachment dimerizes EGFRs which in turn induces clathrin dependent endocytosis of the EGFR-Ligand complex. EGFR has three distinct pathways within the cell: 1) EGFR-ligand complex undergoes lysosomal pH-dependent degradation by ubiquitination or gets recycled back to the cell surface through 2) ligand detachment or 3) UBPY de-ubiquitination enzyme. α2β1-Integrin clusters on cellular membrane after collagen, lamin, Echovirus1 or antibody attachment and gets endocytosed, depending on the ligand, either by clathrin or caveolae-lipidraft dependent endocytosis. Proteinkinase C (PKC) activation affects both integrin and EGFR endocytosis. α2β1-Integrin endocytosis is dependant on PKC α activation. Phosphorylation of EGFR threonine 654 by PKC α inhibits receptor ubiquitination and directs it to recyclive endosomal route. Our previous studies show close proximity between the EGFR and α2β1-Integrin endosomes as they get transported by intracellular pathways but these endosomes vary in pH and have no physical contact. EGFR and Integrin pathways have also been shown to be intertwined together and EV1 Infection through α2β1-Integrin is shown to affect EGFR-degradation. The goal of this study was to illustrate how EV1 infection modifies EGFR-regulation. Lyso- and proteosomal degradation in EV1 infected and uninfected A549 pulmonary cancer cells was inhibited by bafilomycinA, calpain or bortezomib. PKC α studies were performed by activating the kinase with phorbol 12-myristate 13-acetate. Treated cells were imaged with confocal microscope by 2D-imaging of fixed samples or 4D-imaging of live samples. Quantitative image analysis was performed with the BioImageXD image software. Growth factor activated cells were also imaged by transmission electron microscope. Our results show that in our laboratory model EGFR was transported through endosomal structures similar to the transport of EV1- α2β1-Integrin complex. EV1 was shown to affect EGFR transport with resemblance to PKCα activation: EGFR is directed to recyclive endosomal pathway with reduced receptor degradation. Further studies indicated that these results were indeed due to PKCα activation by EV1. The Inhibition of EV1- α2β1-Integrin complex degradation seemed to result in cytoplasmic EGFR accumulation proving that EV1 retains its effects on EGFR pathway also after the endocytosis. These results are consistent with the previous findings that show interplay between the α2β1-Integrin and EGFR. It’s very likely that down regulation of EGFR degradation is beneficial to EV1: Prolonged intracellular signaling by EGFR that regulates mitogenesis through PI3-Akt and Ras-ERK-signaling cascade results in anti-apoptotic signaling. Regulation of these two pathways enables favorable and better conditions for the EV1’s intracellular replication.