Parasetamolin vaikutus myeloperoksidaasin toimintaan

Abstract

Myeloperoksidaasi on neutrofiilien ja monosyyttien entsyymi, joka muuttaa vetyperoksidia bakterisidisiksi yhdisteiksi, kuten hypokloorihapokkeeksi. Myeloperoksidaasia on pidetty neutrofiilien bakterisidiselle toiminnalle elintärkeänä, sillä sen on ajateltu tehostavan neutrofiilien bakteeritappoa merkittävästi. Viimeaikoina on kuitenkin saatu tutkimustuloksia, joiden mukaan veressä vapaana oleva myeloperoksidaasi voisi toimia sairauden aiheuttajana pahentaen muun muassa ateroskleroosin ja nivelreuman oireita. Myeloperoksidaasin tuottamaa hypokloorihapokkeen määrää voidaan mitata epäsuorasti luminolivahvisteisella kemiluminesenssilla. Eristetyn myeloperoksidaasin ja neutrofiilien kykyä tappaa bakteereja on mahdollista tutkia myös suoraan käyttämällä bioluminesoivaa Escherichia coli bakteeria (E.coli -lux), joka sisältää Photorhabdus luminescens bakteerin lusiferaasigeenin. Reaktiosta emittoituva valo on tällöin suoraan verrannollinen reaktiossa olevien E.coli –lux bakteerien määrään. Suosittu kipulääke, parasetamoli, inhiboi myeloperoksidaasin hypokloorihapokkeen tuottoa ja sen on havaittu inhiboivan myös myeloperoksidaasin kemiluminesenssia. Parasetamolin vaikutuksia myeloperoksidaasin bakteeritappoon ei kuitenkaan ole aiemmin tutkittu, eikä parasetamolin vaikutuksia myeloperoksidaasiin ole aiemmin tutkittu mittaamalla kemiluminesenssia yhtäjaksoisesti.

Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää, miten parasetamoli vaikuttaa myeloperoksidaasin kemiluminesenssiin ja bakteeritappoon. Kokeet tehtiin happamassa ja neutraalissa pH:ssa, sillä myeloperoksidaasia on neutrofiilien happamien fagolysosomien lisäksi solun ulkopuolella.

Kaikki mittaukset tehtiin luminometrilla. Myeloperoksidaasin tuottamaa hypokloorihapokkeen määrää mitattiin luminolivälitteisenä kemiluminesenssina eri parasetamolipitoisuuksilla. Bakteeritapon reaktioissa tarkkailtiin myeloperoksidaasin tappamien E. coli -lux bakteerien määrää mittaamalla reaktiosta emittoituvaa bakteerien bioluminesenssia eri parasetamolipitoisuuksilla.

Parasetamoli kasvatti myeloperoksidaasin kemiluminesenssivastetta jopa kymmenkertaisesti pienillä pitoisuuksilla ensimmäisen 15 minuutin aikana, jonka jälkeen sen vaikutus oli inhiboiva. Tämä havaittiin sekä happamassa että neutraalissa pH:ssa. Aktivaatio ja sitä seuraava inhibitio saavutettiin parasetamolin normaalilla käytöllä saavutettavilla pitoisuuksilla veressä, eli alle 22,5 μg/ml (150 μM) pitoisuuksilla. Aktivaatio ja inhibitio ei ollut yhtä voimakasta bakteeritapon reaktioissa, joissa happamassa pH:ssa parasetamolin vaikutus oli myös heikompaa. Suurimmillaan parasetamolin aiheuttama aktivaatio johti vain noin 10 %:in lisäykseen kuolleiden bakteerien määrässä. Tulosten perusteella parasetamoli vaikuttaa myeloperoksidaasin hypokloorihapokkeen muodostumiseen alle 22,5 μg/ml pitoisuuksilla merkittävästi sekä neutraalissa että happamassa pH:ssa. Lisäksi parasetamoli vaikuttaa myeloperoksidaasiin neutraalissa ja happamassa pH:ssa samalla tavalla sekä yhtä voimakkaasti. Parasetamolipitoisuus 22,5 μg/ml on saavutettavissa, kun lääkeainetta käytetään lääkärin ohjeiden mukaisesti, joten olisi tärkeää selvittää, mikä vaikutus myeloperoksidaasin inhibitiolla ja mahdollisella aktivaatiolla on ihmisen elimistön toiminnalle.

Myeloperoxidase is an enzyme found from neutrophils and monocytes. It converts hydrogen peroxide to hypochlorous acid and other bactericidal compounds. Myeloperoxidase has been considered a crucial enzyme for neutrophil bactericidal function, because it is thought to enhance the bacterial killing of neutrophils significantly. However, recent studies have also proven that extracellular myeloperoxidase can have adverse effects in several diseases, like atherosclerosis and arthritis. Hypochlorous acid production by isolated myeloperoxidase and neutrophils can be measured non-specifically with luminol-dependent chemiluminescence. Bactericidal function of isolated myeloperoxidase and neutrophils can be monitored on a real-time basis by using bioluminescent Escherichia coli bacteria (E.coli -lux) which contain a luciferase gene from the Photorhabdus luminescens bacterium. Light emitted from the reaction is directly proportional to the amount of living E.coli -lux bacteria. Paracetamol, a popular analgesic, inhibits hypochlorous acid production by myeloperoxidase with therapeutically achievable concentrations and has been found to inhibit the chemiluminescence response of isolated myeloperoxidase and neutrophils. The effect of paracetamol on myeloperoxidase bacterial killing has not been studied before, and chemiluminescence experiments with paracetamol have not been done on a real-time basis before.

Aim of this study was to investigate the effects of paracetamol on myeloperoxidase chemiluminescence and bacterial killing. Experiments were done in acid and neutral pH, because myeloperoxidase can be intracellular and reside in the acid phagolysosomes of neutrophils or it can be extracellular and function in neutral pH.

All measurements were done with a luminometer. Luminol-dependent chemiluminescence was used to measure the amount of hypochlorous acid produced by myeloperoxidase in the presence of paracetamol. In killing experiments, the amount of E. coli-lux bacteria was measured on a real-time basis in the presence of myeloperoxidase and paracetamol.

Low concentrations of paracetamol activated the myeloperoxidase chemiluminescence up to tenth fold in the first 15 minutes, after which the effect was inhibitory. This observation was made in acid and neutral pH. As expected, activation and inhibition was acquired with concentrations less than 22,5 μg/ml (150 μM), which is the therapeutically achievable concentration in plasma. Activation and inhibition in the killing experiments were not as strong as in the chemiluminescence experiments. The activation only caused a 10 % increase in the killing of bacteria by myeloperoxidase. According to the results of this study, paracetamol affects the hypochlorous acid production of myeloperoxidase at therapeutically achievable concentrations in neutral and acid pH. In addition, paracetamol seems to affect myeloperoxidase in a similar manner and with the same magnitude in both neutral and acid pH. Paracetamol concentration of 22,5 μg/ml in plasma can be achieved when the drug is used according to doctors recommendations. Thus, in the future, it would be important to study the effects of myeloperoxidase inhibition and possible activation on the human body.