Bradavidiinista johdetun bradpeptidin karakterisointi ja soveltuvuus affiniteettikromatografiaan

Abstract

Bradavidiini on Bradyrhizobium japonicum bakteerista löydetty avidiinin ja streptaviidiinin kaltainen proteiini. Avidiini on peräisin kanasta ja streptavidiini Streptomyces avidinii bakteerista. Bradavidiinin aminohapposekvenssi on noin 30 prosenttisesti samankaltainen avidiinin ja streptavidiinin ydinalueiden sekvenssien kanssa. Bradavidiini koostuu 138 aminohaposta ja C-terminaalisesti pienennetty bradavidiini, ns. bradcore, 118 aminohaposta. Bradavidiinilla on useimpien avidiinien tapaan tetrameerinen kvaternaarirakenne ja se muistuttaa sekä rakenteeltaan että toiminnaltaan avidiinia ja streptavidiinia. Bradavidiinilla on muiden avidiinien tapaan kyky sitoa voimakkaasti D-biotiinia. Avidiinien sitoutuminen biotiiniin on johtanut niiden laajaan käyttöön avidiini-biotiini teknologiassa, esim. lääketieteessä geeniterapiaan ja kuvantamiseen. Avidiini ja streptavidiini ovat myös stabiileja lämmön ja pHn vaihteluille sekä proteolyyttisille entsyymeille. Immunologisilta ominaisuuksiltaan bradavidiini on kuitenkin (strept)avidiineista poikkeava. Jäniksen ja ihmisen streptavidiinia tunnistavat seerumit eivät reagoineet bradavidiinin kanssa merkittävästi. Avidiinista ja streptavidiinista poiketen, täysimittaisen bradavidiinin karboksyylipäässä on lyhyt aminohappohäntä, joka kykenee sitoutumaan viereisen monomeerin biotiinia sitovaan kohtaan ja mahdollisesti estämään biotiinin sitoutumisen. Strep-tag ja Strep-tag II ovat yhdeksän aminohappotähteen mittaisia peptidejä, jotka sitoutuvat luontaisesti ja palautuvasti streptavidiinin biotiinia sitovaan kohtaan. Strep-tag ja Strep-tag II peptidejä käytetään mm. affiniteettikahvoina rekombinanttiproteiinien puhdistuksessa sekä analyyttisinä työkaluina immunokemiallisissamäärityksissä. Strep-tag II kykenee Strep-tagista poiketen sitoutumaan streptavidiinin biotiinia sitovaan kohtaan sekä C- että N-terminaalisena fuusiona. Brad-tag on kahdeksan aminohappotähteen pituinen peptidi, jonka sekvenssi (SEKLSNTK) löydettiin bradavidiinin karboksyylipäässä olevasta aminohappohännästä. Isotermisella tirauskalorimetrilla (ITC) tehtyjen mittausten perusteella bradpeptidi sitoutuu bradavidiiniin, mutta ei sitoudu avidiiniin tai rhizavidiiniin. Bradpeptidin affiniteetti bradavidiinin C-terminaalisesti lyhennettyyn muotoon, bradcoreen, on hieman suurempi kuin Strep-tag ja Strep-tag II peptidien affiniteetti streptavidiiniin. Näiden lupaavien tutkimusten perusteella tuotettiin tehostetun vihreä fluoresoivan proteiinin (EGFP) kanssa bradtag-EGFP fuusioproteiineja. Fuusio tehtiin joko EGFPn C- tai N-terminaaliin. Tarkoituksena oli selvittää toimiiko Brad-tag fuusioproteiinissa ja onko C- tai N-terminaalisilla fuusioilla eroa. Mutatoitujen bradpeptidien affiniteettia bradcoreen pyrittiin selvittämään ITC-mittauksilla. Bradtag-EGFP fuusioproteiineja saatiin tuotettua, kuitenkin N-terminaalisen Brad-tagin sisältävien fuusioproteiinien tuottotasot olivat huomattavasti C-terminaalisia Brad-tag fuusioproteiineja korkeammat. Erilaisilla bradcore-resiiniin tehdyillä sitoutus- ja puhdistuskokeilla selvitettiin, että Brad-tag sitoutuu EGFPn aminoterminaalisena fuusiona bradcoren biotiinia sitovaan kohtaan ja sitä voidaan käyttää aminoterminaalisena affiniteettikahvana. Mutaatioilla havaittiin olevan heikentävä vaikutus bradpeptidien ja bradcoren välisessä sitoutumisessa.