Enterovirusten detektio haimakudoksesta in situ -hybridisaatiolla ja immunofluoresenssiinperustuvalla kaksoisvärjäysmenetelmällä

Abstract

Ihmistä infektoivat enterovirukset luokitellaan ihmisen enterovirus A-, B-, C- ja D -lajeihin sekä rinoviruslajeihin. Nämä lajit sisältävät runsaasti alalajeja, joita tunnetaankin yli 200. Enterovirus on pieni, ikosahedraalinen, genomiltaan yksijuosteinen ja positiivissäikeinen RNA-virus, joka on yleinen taudinaiheuttaja kaikissa ikäryhmissä. Enterovirusinfektioiden epäillään olevan monien autoimmuunisairauksien patogeneesin taustalla. Enteroviruksia pidetään todennäköisimpänä tyypin 1 diabetesta (T1D) aiheuttavana virussukuna, sillä enterovirusinfektioita on todettu diabeetikoilta terveitä useammin monissa eri tutkimuksissa. Vaikka enterovirusinfektiot on yhdistetty T1D:n patogeneesiin, ei enterovirusten osuutta sairauden puhkeamisessa ole kyetty täysin todistamaan. Enterovirusten ja T1D:n välisen epidemiologisen yhteyden osoittaminen on haastavaa, sillä tutkimuksia vaikeuttavat T1D:n oireeton, jopa vuosia kestävä esivaihe sekä haimakudosnäytteiden heikko saatavuus. Vaikka enterovirusdetektiossa immunohistokemialliset menetelmät (IHC) ja in situ -hybridisaatio(ISH) ovat osoittautuneet toimiviksi formaliinifiksattuja kudosnäytteitä käytettäessä, tulee näitä menetelmiä edelleen kehittää detektion luotettavuuden varmistamiseksi. Tutkielman tarkoituksena oli vahvistaa enterovirusdetektion luotettavuutta suunnittelemillamme lajispesifisillä koettimilla sekä omassa laboratoriossamme tuotetuilla polyklonaalisilla enterovirusvasta-aineilla ja arvioida näiden soveltuvuutta enterovirusdetektioon haimakudoksesta. Tutkielman tarkoituksena oli myös selventää tietoa enterovirusten isäntäsoluspesifisyydestä ihmisen haimakudoksessa. Tutkimuksessa näytemateriaalina käytettiin formaliinifiksattuja ja parafiiniin valettuja ihmisten haimakudosleikkeitä ja Balb/c-hiirten monikudosleikkeitä. Enterovirusvastaaineina käytettiin polyklonaalisia kanin vasta-aineita, jotka olivat suunniteltu coxsackievirus A16 (CAV16)-, coxsackievirus B3 (CBV3)- ja echovirus 11 -spesifisiksi. Tutkimuksessa käytettiin ISH-menetelmää sekä kahta erilaista IHC-menetelmää: immunoperoksidaasivärjäystä sekä immunofluoresenssiin perustuvaa kaksoisvärjäystä (IFA). Immunoperoksidaasivärjäyksen avulla seulottiin enteroviruksia ihmisen haimakudosleikkeistä (n=12). Viruspositiivisuutta löydettiin kolmesta haimakudoksesta CAV16 spesifisellä vasta-aineella. CBV3- ja Echo11 -vasta-aineilla positiivisuutta ei löydetty. CAV16 saarekesoluspesifisyyden määrittämiseksi IFA toteutettiin käyttäen CAV16 vasta-ainetta sekä kaupallisia vasta-aineita saarekesoluspesifisiä peptidihormoneja insuliinia, glukagonia ja somatostatiinia vastaan. ISH-määritystä varten enteroviruslajispesifiset DNA-koettimet suunniteltiin sitoutumaan enterovirusgenomin konservoituneille 2C- ja 3D -geenialueille. Lisäksi suunniteltiin koetin, joka sitoutuu enteroviruksen negatiiviseen RNA-juosteeseen, jota virus käyttää templaattina replikaatiossaan. ISH-menetelmä optimoitiin CBV3 infektoidun Balb/c -hiiren kudosleikkeillä. IFA:n mukaan CAV16 infektio rajoittuu haimakudoksessa ainoastaan saarekkeiden insuliinia tuottaviin β-soluihin ja tulokset tukevat yleistä käsitystä enterovirusinfektion β-soluspesifisyydestä. Löytö on merkittävä sillä CAV16 saarekesoluspesifisyyttä ei ole aiemmin osoitettu. Ainoastaan enterovirus B-lajispesifiset koettimet sekä enteroviruksen negatiiviseen juosteeseen sitoutuva koetin, tunnistivat CBV3-virusta hiiren haimakudoksesta, mikä viittaa lajispesifiseen hybridisoitumiseen. Koettimien yhtäaikainen käyttö samassa ISH-reaktiossa ei häirinnyt enterovirus B-lajispesifisten koettimien hybridisoitumista. Itsesuunnitellut koettimet sekä itsetuotetut vasta-aineet lisäävät enterovirusdetektion luotettavuutta merkittävästi, varsinkin jos niitä käytetään kaupallisten koettimien ja vasta-aineiden rinnalla.