Patrik Michelin väitöskirjan aiheena on useiden erityyppisten rekombinanttiproteiinien tuotto, puhdistus ja karakterisointi. Rekombinanttiproteiinit ovat keskeisessä asemassa kehitettäessä uusia diagnostisia menetelmiä. Näiden proteiinien tuotossa organismiin lisätään muokattua vierasta geneettistä materiaalia, jotta organismi tuottaisi tavoiteltua proteiinia. Tuottoprosessit sisältävät puhdistusvaiheita, jotta haluttu proteiini voidaan eristää elävästä, monimutkaisesta lähtömateriaalista. Tuottoprosessissa on ainakin seuraavat vaiheet: tuotto-organismin kasvatus, rekombinanttiproteiinien tuotto isäntäsolussa ja lopputuotteen jälkikäsittely. Tämän jälkeen rekombinanttiproteiineja voidaan käyttää mm. entsyymiteknologiassa ja erilaisten tautien tunnistamisessa.Tutkimuksessa tuotettiin bakuloviruksen avulla hyönteissoluissa tulikärpäsen lusiferaasientsyymi, Epstein–Barr-viruksesta peräisin oleva Epstein–Barr-tuma-antigeeni-1 (EBNA-1) sekä ihmisen parvorokkoviruksen rakenneproteiinit VP1
ja VP2. Proteiinien kloonauksessa käytettiin tekniikkaa, jossa proteiinien amino- tai karboksyyliterminukseen lisättiin polyhistidiinihäntä (kuusi kertaa histidiiniaminohappo) vaikuttamatta lopputuotteen biologiseen aktiivisuuteen. Tämä tekniikka lyhensi puhdistusprotokollan muutamaan vaiheeseen.Michel käytti tutkimuksessaan uusia puhdistusprosesseja eristääkseen solusta lopputuotteita. Prosessissa pystyttiin todistamaan, että näin tuotetut proteiinit olivat yhtä aktiivisia kuin perinteisin puhdistusmetodein tuotetut. Tulikärpäsen lusiferaasientsyymi osoitettiin käyttökelpoiseksi ATP:n eli elävien organismien määrityksessä. Tuotettu Epstein–Barr-tuma-antigeeni-1 todistettiin olevan hyvä reagenssi Epstein–Barr-viruksen vasta-aineiden mittaamisessa. Epstein–Barr-virus voi aiheuttaa ihmisille mononukleoosin, kansanomaisemmin "pusutaudin". Viruksen kantaminen voi olla oireetonta, mutta aikuisella oireet voivat olla myös voimakkaat: korkeaa kuumetta, nielutulehdusta, lihaskipuja, imusolmukkeiden ja pernan suurenemista. Virus voi myös aiheuttaa erilaisia syöpäsairauksia, joista yleisin on lymfooma eli imusolmukesyöpä. Tutkimuksessa tuotettujen ihmisen parvorokkoviruksen rakenneproteiinien VP1 ja VP2 todettiin olevan potentiaalisia reagensseja parvorokkoviruksen vasta-aineiden määrittelyssä. Lapsilla tämä virus ilmenee ihottumana, joka alkaa punoituksena poskilla leviten muualle kehoon. Virus voi olla erityisen vaarallinen raskaana oleville, koska se lisää keskenmenoriskiä.Michelin tutkimus edistää diagnostisen rekombinanttiproteiinien saantia kehittäen puhdistusprosesseja, joissa proteiinit saadaan eristettyä solusta edullisesti, tasalaatuisesti ja lähes massatuotantona. Menetelmien kehitys on merkittävää erityisesti biolääketieteelliselle teollisuudelle. Työ osittaa, että menetelmien kehittämisellä voi olla merkittävää hyötyä teollisuudelle tuottomenetelmien tehostumisena.
...
Living organisms are widely used for the production of recombinant proteins. The baculovirus expression vector system (BEVS) has become a popular choice for diverse recombinant protein production. Moreover, the insect cells used in the BEVS are able to perform most post-translational modifications of proteins with eukaryotic or viral origin. Recombinant proteins can be used in many fields such as in enzyme technology or in disease diagnostics. In general, the proteins must be extracted from the insect cells before their final use. For that, there are various schemes available. The conventional methods are often time consuming and laborious. In addition, they usually allow only limited working volumes to be processed. The addition of purification tags such as a polyhistidine tag to the N- or C terminus of the protein enables the use of affinity chromatography without affecting correct protein folding. Immobilized metal-ion affinity chromatography (IMAC) is the technique used for polyhi
stidine-tagged proteins. IMAC can be coupled with expanded-bed adsorption chromatography (EBA) for large-scale applications. Here, the coleopteran firefly luciferase of Photinus pyralis, the Epstein-Barr virus (EBV) protein, the Epstein-Barr nuclear antigen-1 (EBNA-1) and finally the viral capsid proteins VP1 and VP2 of human parvovirus B19 were produced using the BEVS. The proteins were genetically modified to include a polyhistidine tag and purified by using IMAC. In addition, the scalability of the system was assessed by purifying the firefly luciferase with the EBA. The abilities of the recombinant protein products were shown to have similar properties compared to the authentic counterparts or to previously characterized recombinant proteins. The tagged firefly luciferase was an excellent reagent in ATP monitoring. Similarly, the recombinant antigens for diagnosis of oncogenic virus EBV and human pathogenic the B19 infections appeared to work very well in ELISA:s. In addition, complex formation between VP2 virus-like particles of B19 and antibodies present both in acute and past-immunity sera was shown by fluorescence correlation spectroscopy. Together, the results presented in this thesis demonstrate that the addition of a polyhistidine tag to the recombinant proteins produced in insect cells can facilitate the purification process without affecting the final use. The set-up is therefore attractive when large-scale production and purification of proteins with diagnostic potential is under study.
...
