Integrin-mediated entry of echovirus 1

Abstract

Paula Upla selvitti väitöskirjassaan echovirus 1:n solunsisäistä reittiä ja tunnisti solurakenteita ja säätelijöitä, jotka ovat tärkeitä infektiossa. Echovirus 1 (EV1) kuuluu pikornavirusperheeseen, jonka muita tunnettuja edustajia ovat poliovirus sekä karjan suu- ja sorkkatautivirus. EV1 on pieni (25-30 nm), vaipaton RNA-virus. EV1 aiheuttaa useimmiten oireettomia tai vähäoireisia suolisto- ja hengitystieinfektioita, mutta myös vakavampia tiloja, kuten aivokalvontulehdusta.Upla seurasi viruksen tunkeutumista soluun käyttäen elektronimikroskopiaa sekä tehokasta kolmi- ja neliulotteista konfokaalimikroskopiaa. Näin hän pystyi havainnoimaan yhtä aikaa usean eri molekyylin vuorovaikutusta niihin liitettyjen merkkiaineiden perusteella.- Löysimme uudenlaisen reitin, jossa virus reseptoreineen päätyi vasta muutama vuosi sitten kuvattuihin soluelimiin, kaveosomeihin. Kaveosomien toiminnasta tai yhteyksistä muihin solunsisäisiin kuljetusreitteihin ei ole vielä kovin paljon tutkimustietoa. Kaveosomeista EV1 ei siirtynyt muihin soluelimiin eli viruksen RNA todennäköisesti vapautuu kaveosomeista monistettavaksi solulimaan, Upla kertoo.Upla osoitti myös EV1:n RNA:n monistumisen olevan riippuvaista solun proteiineja pilkkovista entsyymeistä, kalpaiineista. Muokkaamalla eri kohdemolekyylejään kalpaiinit säätelevät lukuisia toimintoja soluissa. Kalpaiinien yliaktiivisuus on yhdistetty vakaviin sairauksiin, mm. Alzheimerin tautiin. Myös muut testatut pikornavirukset, ihmisen parechovirus 1 (HPEV1) sekä coxsackievirus B3 (CVB3) tarvitsivat kalpaiiniaktiivisuutta infektioissaan. Kalpaiinit saattavat liittyä erityisien, RNA:n monistumisessa tarvittavien kalvorakennelmien muodostamiseen.Biokuvantaminen auttaa ymmärtämään infektioiden syntyäVaikka pikornavirusten rakenne ja perimä tunnetaan hyvin, niiden taudinaiheuttamismekanismi molekyylitasolla on melko tuntematon. Nykyiset tehokkaat biokuvantamismenetelmät mahdollistavat virus-reseptori -vuorovaikutuksen seuraamisen niiden luonnollisessa ympäristössä ja lisäävät infektioiden synnyn ymmärtämistä. Tämä on pohjana virustautien ehkäisyn, diagnostiikan ja hoidon kehittelylle. Lisäksi viruksia voidaan hyödyntää geenien kuljettimina eli vektoreina ja kasvainsolujen kohdistetussa tuhoamisessa.Virukset toimivat myös arvokkaina työkaluina tutkittaessa solun normaaleja toimintoja, mm. aineiden sisäänottoa. Integriinit ovat tarttumisreseptoreja, jotka läpäisevät solukalvon. Integriinit myös välittävät viestejä solukalvon yli molempiin suuntiin ja säätelevät näin solujen kasvua, liikkumista, erilaistumista ja kuolemaa. Häiriöt integriinien toiminnassa voivat johtaa sairauksiin, kuten veritulppaan, tulehduksiin ja syöpään.Vaikka integriinien tehtävä pääasiallisesti on pitää solut paikallaan, ne voivat kulkea myös solun sisään. Näin tapahtuu etenkin solujen liikkuessa alustaansa pitkin. Syöpäsoluissa integriinien ilmentäminen ja toiminta muuttuvat, mikä johtaa solujen liikkumisen lisääntymiseen ja syövän leviämiseen kasvaimesta terveeseen kudokseen. Integriinien solunsisäisen liikenteen mekanismista ja säätelystä ei tiedetä vielä kovin paljon. Upla selvensi integriinien käyttäytymistä osoittamalla, että a2b1-integriini päätyykin soluliman kaveosomeihin eikä solukalvolle takaisin kierrättäviin rakenteisiin, kuten aiemmin on kuvattu. Kun kaveosomien toiminta tunnetaan paremmin, ne voivat olla täsmähoitokohde integriineille esimerkiksi syövissä.

Echovirus 1 (EV1) is a human pathogen, which belongs to the Picornaviridae family of RNA viruses. Here, the life cycle of EV1 was analyzed in detail. Binding of EV1 to the cell surface a2b1 integrin, a collagen receptor, was not accompanied by a conformational change in the virus capsid needed for the release of the RNA genome. EV1 pentamer is supposed to bind five integrin heterodimers at the same time and, behaving as a multivalent ligand, to cause integrin clustering. Clustering of integrins is important for signaling events. Formation of integrin clusters was initiated using primary anti-a2 integrin and secondary antibodies. The receptor clusters were seen to move laterally from glycosyl phosphatidylinositol anchored protein (GPI-AP) enriched domains along cortical actin filaments and to subsequently internalize. The internalization process was dependent on protein kinase Ca (PKCa) activity and other signaling events. Integrin a2b1 clustered by antibodies or EV1 was internalized into perinuclearly accumulated vesicles positive for caveolin-1, but not in endosomal vesicles of the clathrin-dependent entry route.The perinuclear vesicles were caveosomes, since EV1 partially colocalized there with simian virus 40 (SV40) and cholera toxin, known to traffic via caveosomes. However, colocalization of EV1 with caveolin-1 was not evident at the plasma membrane, but became apparent during the first 10 to 20 min of internalization. EV1 did not move to any other cellular locations from caveosomes. Presumably the EV1 RNA genome is released directly from the caveosomes to initiate replication in the cytoplasm.The replication of EV1 was dependent on cytosolic Ca2+-activated cysteine proteases, calpains, which degrade a number of cytoskeletal and cytoplasmic proteins. Both calpains 1 and 2 were recruited into caveosomes and they were activated concomitantly with the increase in Ca2+ concentration. Calpain inhibitors, as well as siRNAs for calpains 1 and 2, blocked EV1 infection. However, calpain inhibition did not have preventive effect on the in vitro translation of viral proteins.