Aineenvaihduntareittien fluksomiikan analysointi lihassoluista UHPLC-MS-menetelmällä

Abstract

Tämän Pro gradu -tutkimuksen kirjallisessa osassa perehdytään pintaa syvemmälle solujen metabolomiikkaan sekä fluksomiikkaan. Kirjallisen osan alussa käsitellään solujen toimintaa perustasolla ja käydään läpi tutkimuksen osalta tärkeimpiä aineenvaihduntareittejä ja niiden tuottamia aineenvaihduntatuotteita eli metaboliitteja. Tämän jälkeen kirjallinen osa keskittyy käsittelemään fluksomiikkaa syvemmällä tasolla ja sitä, kuinka isotooppileimaus on isossa roolissa sen tutkimuksessa. Näiden edellä mainittujen aiheiden lisäksi kirjallisessa osassa käsitellään nykypäivänä metabolomiikan ja fluksomiikan tutkimuksessa yleisimmin käytettyjä analyysimenetelmiä, kuten massaspektrometriaa, nestekromatografiaa, ydinmagneettista resonanssispektroskopiaa sekä kaasukromatografiaa. Kirjallisen osan loppupuolella käsitellään tutkimuksessa keskeisessä roolissa olevia analyysimenetelmien yhdistelmiä, kuten LC-MS- ja GC-MS-analytiikkaa.

Kokeellisen osan tarkoituksena oli perehtyä ihmisen sekä hiiren lihassolunäytteiden soluviljelyyn, näytteiden keräykseen sekä näytteiden analysoitiin UHPLC-QQQ-MS-laitteistoa hyödyntäen. Tutkimuksessa perehdyttiin syvemmin, kuinka lihassolujen aineenvaihduntareitit tuottavat tiettyjä kiinnostuksen kohteena olevia aminohappoja sekä kuinka nopeasti ne tuottavat niitä tietyissä aikapisteissä. Näytteiden analysoinnin osalta tutkimuksessa keskityttiin ensin optimoimaan UHPLC-MS/MS-menetelmää kuoppatestin sekä aikapistevertailun avulla. Kun menetelmä oli saatu optimoitua mittauksiin sopivaksi, analysoitiin ihmisen lihassolunäytteistä aineenvaihduntareittien virtausnopeutta eli fluksomiikkaa. Fluksomiikan tutkimisessa hyödynnetiin isotooppileimausta, jossa ihmisen lihassolujen annettiin vaikuttaa 13C isotooppileimatun glukoosiliuoksen kanssa eri aikapisteiden verran. Isotooppileimattuja glukoosiliuoksia valmistettiin kokeellista osaa varten kahta erilaista, joissa niiden pitoisuudet säädettiin HS (horse serum) - ja FBS (fetal bovine serum) -seerumien avulla 2 ja 20 prosenttisiksi. Eri seerumipitoisten gluukosiliuosten tarkoituksena oli stimuloida ihmisen lihassolujen aineenvaihduntareittejä ja tarkoituksena oli analysoida, onko isotooppileimatun glukoosiliuoksen väkevyydellä merkittävää vaikutusta aminohappojen tuotantoon.