JZP-AoF-compounds against mycobacterium biofilms : efficacy and safety

Abstract

Tuberkuloosi on infektiosairaus, jonka aiheuttaja on bakteeri Mycobacterium tuberculosis. Vuosittain tuberkuloosin sairastuu yli 10 miljoonaa ihmistä ympäri maailman, ja sairaus aiheuttaa kuolleisuutta etenkin lapsissa ja muissa immuunipuutteisissa väestöryhmissä. Yleisesti tuberkuloosin hoidossa on käytössä neljän eri antibiootin yhdistelmä. Hoito on pitkä, kestäen yleensä vähintään kuusi kuukautta. Lisäksi M. tuberculosis on luontaisesti tolerantti monille antibiooteille, sillä se kykenee muun muassa vaipumaan lepotilaan sekä piilottelemaan itsetuotetussa, soluväliaineesta koostuvassa biofilmissä. Pitkittyvä hoito myös lisää riskiä geneettisesti resistenttien kantojen syntyyn. Uusia strategioita tarvitaankin tehostamaan tuberkuloosin hoitoa, jotta myös tolerantit bakteerit saadaan tehokkaasti eliminoitua infektion aikana. Tehosteaineiden käyttö antibioottien rinnalla on yksi mahdollinen tapa saada antibiootit tehoamaan paremmin. Jotkin yhdisteet voivat toimia biofilmi-inhibiittoreina estäen biofilmin syntyä tai hajottaen biofilmin rakennetta, jolloin antibiootit saavuttavat biofilmissä elävät bakteerit paremmin. Tämän pro gradu -tutkielman tarkoituksena olikin selvittää 25:n uuden johdannaisen potentiaali toimia biofilmin rakennetta heikentävänä tehosteyhdisteenä tavallisesti tuberkuloosin hoidossa käytetylle antibiootille, rifampisiinille. Tehokkuuttta tutkittiin Lux MDK (minimum duration of killing) -koeasetelmalla. Lux MDK-analyysi perustuu luminesenssin muutokseen, kun bioluminesenssia tuottavan bakteerin kasvua inhiboidaan antibakteerisilla aineilla. Tulokset vahvistettiin CFU maljaukseen perustuvalla MDK-analyysillä. Parhaiden yhdisteiden turvallisuutta testattiin myös seeprakalan alkioille tehdyllä toksisuustestauksella. Tutkimuksen mukaan yksi testatuista johdannaisista, JZP-AoF-249F, erottui muista tehokkuudessa. Se auttoi Lux MDK-analyysin perusteella rifampisiinia inhiboimaan 99 %:a koko bakteeripopulaatiosta kaksi kertaa nopeammin kuin rifampisiini, kun testikonsentraationa oli 40 µM. Lisäksi yhdistelmähoito eliminoi mykobakteereja CFU-maljauksen mukaan tilastollisesti merkittävästi tehokkaammin kuin rifampisiini yksin kaikilla testatuilla konsentraatioilla. Yhdiste oli myös toksisuustestin perusteella melko turvallinen (LC50=307.6 µM).

Tuberculosis is an infectious disease which is caused by Mycobacterium tuberculosis. Annually over 10 million people fall ill with tuberculosis worldwide, and it causes mortality, especially among immunocompromised people and children. Tuberculosis is commonly treated with four first-line antibiotics. The treatment is long, lasting normally up to six to nine months. In addition, M. tuberculosis is naturally tolerant to many antibiotics because the bacteria can, for instance, enter a state of dormancy or hide in self-produced biofilm matrixes. The extensive treatment time also increases the risk of emerging genetically resistant strains. Because the current tuberculosis treatment is so inefficient, new strategies are needed to shorten the treatment and eliminate the tolerant sub-populations. One possible treatment strategy is to use adjunct compounds along with conventional antibiotics. The adjunct compounds could act as biofilm inhibitors which prevent the formation of biofilms or disrupt mature biofilms so that conventional antibiotics can target all bacteria in the infection site, including the tolerant sub-populations. Thus, this thesis aimed to study the killing efficacy of 25 new anti-biofilm compounds against mycobacterial biofilms when used with a conventional antibiotic, rifampicin. The efficacy was studied using Lux MDK (minimum duration of killing) -assay and CFU (colony forming unit) plating based MDK-assay. The idea of Lux MDK-assay is based on a change of bioluminescence when transgenic, bioluminescence-producing bacteria are eliminated from biofilms. CFU-plating was used to confirm that the treatment kills the bacteria and not just inhibits the growth. Additionally, the safety of the best compounds was studied with an acute embryonic toxicity test, in which, zebrafish embryos were exposed to the tested compounds. One hit compound, JZP-AoF-249F, was found in this study. Together with rifampicin, in the concentration of 40 µM, it inhibited the growth of 99% of the whole bacteria population twice as fast as rifampicin alone. In CFU plating the combination treatment of this compound and rifampicin was statistically significantly more efficient than rifampicin alone in all tested concentrations from 10 µM to 160 µM. According to the acute embryonic toxicity test, compound JZO-AoF-249F was also safe for the embryos with LC50 of 307.6 µM.