Validation of HT-29 cell differentiation protocol and the use of HT-29 cell model as an infection model

Abstract

In vitro -solumallit ovat tärkeitä työkaluja isäntä-patogeeni-vuorovaikutuksen ja mikrobien käyttäytymisen tutkimuksessa, ja niitä tarvitaan erityisesti bakteeritutkimuksessa, sillä nisäkässolumallit vastaavat paremmin in vivo -ympäristöä kuin pelkkä bakteeriviljely. Lukuisat virukset ja bakteerit, kuten enterovirukset ja Pseudomonas aeruginosa -bakteeri, aiheuttavat infektioita, joita vastaan ei ole parannuskeinoa, tai infektioiden hoitaminen on vaikeaa. Etenkin Pseudomonas aeruginosa -bakteerin tutkiminen in vitro -solumalleissa on tärkeää, sillä bakteeri on vastustuskykyinen useille antibiooteille ja aiheuttaa sairaalaperäisiä infektioita. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli perustaa ja validoida uusi HT-29 solumalli ja sen erilaistamisprotokolla tutkimuskäyttöön Jyväskylän yliopistolle. Hypoteesina oli, että tämä solumalli voidaan erilaistaa limaa tuottaviksi soluiksi, joita voidaan monipuolisesti käyttää jatkossa infektiomallina. Solut erilaistettiin limaa tuottaviksi soluiksi kasvattamalla niitä kahdeksan päivää topografisella pinnalla. Erilaistuneet solut värjättiin Alcian blue -värillä ja testattiin MUC2, villiini ja lysotsyymi vasta-aineilla erilaistumisen ja liman tuoton toteamiseksi. Lisäksi erilaistuneet ja erilaistumattomat HT-29 solut infektoitiin coxsackie A9 enteroviruksella, coxsackie B3 enteroviruksella, OC43 koronaviruksella, Pseudomonas aeruginosa -bakteerin kannoilla PA14 ja 573, Salmonella enterica -bakteerin typhimurium -serotyypillä, Streptococcus mutans -bakteerilla ja Acinetobacter baumannii -bakteerilla, jotta nähdään mitkä patogeeneistä kykenevät infektoimaan näitä soluja ja minkä patogeenien tutkimiseen tätä solulinjaa voidaan tulevaisuudessa käyttää. Vasta-ainetestit eivät kunnolla osoittaneet erilaistumisen onnistumista, mutta Alcian blue -värjäys osoitti. Testatuista patogeeneistä enterovirukset ja molemmat Pseudomonas aeruginosa -kannat infektoivat soluja ja niitä voi tutkia HT-29 solumallissa jatkossakin. Salmonella enterica bakteerin typhimurium -serotyyppi infektoi lievästi molempia soluja ja Streptococcus mutans lievästi vain erilaistumattomia soluja. Acinetobacter baumannii ei ollut infektiokykyinen. Erilaistettujen limaa tuottavien solujen käyttö laajentaa tutkimusmahdollisuuksia. Tutkimus liman ominaisuuksista patogeenejä ja infektioita vastaan antaa arvokasta tietoa limakalvojen immuunivasteesta ja auttaa ymmärtämään infektion eri vaiheita ja kehittämään uusia lääkkeitä patogeenejä vastaan.

Knowledge of host-pathogen interaction is important for understanding different microbes and their behaviour. In vitro cell models are important tools in research to examine host-pathogen interaction and the behaviour of pathogens and they are especially needed with bacterial research, because mammalian cell models resemble the in vivo conditions better than traditional bacterial culture. There are several viruses and bacteria, for example enteroviruses and Pseudomonas aeruginosa bacterium, that cause infections towards which there is no cure, or the infections are difficult to treat. Especially studies of the properties of Pseudomonas aeruginosa bacterium in in vitro cell models are needed because the bacterium is resistant to various antibiotics and causes hospital acquired infections. The aim of this study was to establish and validate a novel HT-29 cell model and its differentiation protocol for research use at the University of Jyväskylä. The hypothesis was that this cell line can be differentiated into mucus producing cells which can be of versatile use in the future. The cells were cultured in a specific topographic surface for eight days to differentiate them into mucusproducing cells. The differentiated cells were stained with Alcian blue stain and tested with MUC2, villin, and lysozyme antibodies to verify their differentiation and mucus production. Additionally, the differentiated and undifferentiated HT29 cells were infected with coxsackievirus A9, coxsackievirus B3, coronavirus OC43, Pseudomonas aeruginosa strains PA14 and 573, Salmonella enterica serovar typhimurium, Streptococcus mutans and Acinetobacter baumannii to discover which of the microbes infect the cells and thus, could be utilised for research in the future. The antibody test results did not fully confirm successful differentiation of the cells, but Alcian blue staining did. From the tested pathogens, enteroviruses and both Pseudomonas aeruginosa strains infected the cells and can be used as an infection model in the future with these cells. Salmonella enterica serovar typhimurium infected both cells mildly, while Streptococcus mutans infected mildly only the undifferentiated cells. Acinetobacter baumannii was not infective. The use of differentiated mucus producing cells expands the future research possibilities. Studying the functions of the mucus against pathogens and infections gives valuable information about the immune response of the mucous membranes and can help in understanding the different phases of infections and in developing new medical approaches against pathogens.