Yhdistetyn hypertrofia- ja angiogeneesiterapian vaikutus lihassolukokoon, solutyyppiin ja lihassolujen tumien määrään hiirillä

Abstract

Tässä pro gradu -tutkielmassa tutkittiin eri geeniterapiahoitojen vaikutuksia hiirten luurankolihaskudoksen kokoon sekä kapillaarien määrään. Lisäksi haluttiin selvittää, voidaanko lihasten solukokoa ja kapillaarien määrää kasvattaa suhteessa niin, että saadaan metabolisesti terve kudos. Hiiret jaettiin neljään ryhmään ja jokaista eri hoitomuotoa saanutta ryhmää verrattiin keskenään, sekä tyypin IIB ja muiden lihassolutyyppien osalta. Loppujen lopuksi hiirillä tutkittiin TA lihaksen lihassolujakaumaa, lihastumien määrää sekä lihassolun poikkipinta-alaa.

Hiirten lopetus ja preparaatio suoritettiin jo aiemmin ennen tätä tutkimusta. Kudosleikkeet ja muu immunohistokemiallinen protokolla suoritettiin Liikuntatieteellisen tiedekunnan laboratoriossa. Tutkimuksessa käytettiin 10 viikon ikäisiä C57BL/6J uroshiiriä, joihin injektoitiin anestesian aikana rekombinantti-adeno-assosioituneita virusvektoreita (rAAV) lihaksensisäisesti molempien raajojen TA lihaksiin 30 µl/TA, joista vain yhtä TA lihasta käytettiin tässä tutkimuksessa. Tutkimuksessa oli mukana yhteensä 20 hiirtä, jotka jaettiin satunnaisesti neljään eri ryhmään: kontrolli, VEGF-B, Pro-MSTN ja yhdistelmäryhmä. Kokeen aikana yksi hiiristä kuoli, joten kaikissa muissa ryhmissä oli viisi (5) hiirtä paitsi kontrolliryhmässä neljä (4). Jäätyneet leikkeet ilmakuivattiin huoneenlämmössä 10 min, jonka jälkeen ne pestiin PBS:llä, fiksattiin -20ºC asteisessa metanolissa 10 minuuttia, pestiin PBS:llä ja blokattiin NGS:llä 1 h. Leikkeille asetetiin primääri vasta-aineet ja annettiin inkuboitua 1 h tai yön yli +4 asteessa ja pestiin 3x5 min BPS:llä. Sen jälkeen laitettiin sekundaari vasta-aineet, annettiin inkuboitua huoneenlämmössä 1 h ja pestiin 3x5 min PBS:llä. Viimeisenä objektilasit kuivattiin, puhdistettiin ja kiinnitettiin. Värjäyksen jälkeen näytteet kuvattiin konfokaalimikroskoopilla (Zeiss LSM 700) 20 x suurennoksella. Kuva-analyysit suoritettiin ImageJ Fiji ja MyoVision ohjelmistoilla. Tilastollisina menetelminä käytettiin Microsoft Excel- ja GraphPad Prism 9 -ohjelmaa. Tulokset normalisoitiin Shapiro-Wilk-testillä ja analysoitiin yksisuuntaisella varianssianalyysilla (one-way ANOVA). Ei-parametriset muuttujat, kuten ryhmien väliset muuttujat analysoitiin Kruskal-Wallis-testillä. Tilastollisesti merkitseväksi arvoksi asetettiin p-arvo <0.05.

Tämän tutkimuksen perusteella hiirten TA lihasten painoa kasvatti eniten yhdistelmähoito (VEGF-B+Pro-MSTN). Yhdistelmäryhmän hiirillä TA lihakset painoivat 31,9 % enemmän kuin kontrolliryhmän hiirillä. Tutkimuksessa selvisi myös, että pelkkä VEGF-B hoito kasvatti tyypin IIB ja muun tyypin lihassolujen poikkipinta-alaa 10 %. Lihassolujen tumien määrässä tai lihassolujakaumassa ei havaittu merkitseviä muutoksia tutkimuksen aikana