HPLC-MS/MS-menetelmän kehittäminen testosteronin ja kortikosteronin kvantitatiiviseksi määrittämiseksi linnun veriplasmasta

Abstract

Tämän työn tarkoituksena oli kehittää ja validoida menetelmä Jyväskylän yliopiston Kemian laitoksella jo valmiiksi olevalle HPLC-ESI-QqQ-laitteistolle siten, että menetelmällä saataisiin kvantitatiivisesti määritettyä kortikosteroni- ja testosteronipitoisuudet hyvin vähäisestä määrästä linnun veriplasmaa ilman näytteiden derivatisointia. Laiteparametrien optimointi suoritettiin kokeilemalla eri parametrien vaikutusta testosteronin ja kortikosteronin erottuvuuteen ja vasteeseen ja valitsemalla parametreista sellaiset, joilla kyseisten yhdisteiden erottuvuus oli selkein ja vaste suurin. Työssä optimoidulla menetelmällä saadaan määritettyä kvantitatiivisesti kortikosteroni ja testosteroni 10 mikrolitrasta linnun veriplasmaa ilman näytteiden derivatisointia suuruusluokassa ng/ml. Työssä saadut määritysrajat (LOQ) olivat kortikosteronille 2,72 ng/ml ja testosteronille 3,17 ng/ml. Saadut määritysrajat ovat selvästi liian suuret, sillä jos määritysrajoina käytettäisiin pienimmän pitoisuuden standardiliuoksia, niin kortikosteronille määritysrajaksi tulisi 1,18 ng/ml (S/N = 12,5) ja testosteronille 0,98 ng/ml (S/N = 39,1). Korkean signaali-kohinasuhteen takia testosteronille saataisiin vielä tätäkin huomattavasti alhaisempi määritysraja. Hajonnat kaikissa työssä tehdyissä mittauksissa olivat alle 15 % (CV%) ja QC-näytteiden tarkkuudet testosteronille olivat 94–101 %, mutta kortikosteronille 82–83 %. Kortikosteronin alhaisiin tarkkuuksiin saattoi vaikuttaa käytetty sisäinen standardi (13C3-testosteroni), joka korjasi kortikosteronin kalibrointisuoran kulmakertoimen liian jyrkäksi. Kalibrointisuorien selitysasteet olivat kortikosteronille 0,9939 ja testosteronille 0,9954.