Konjugatiivisten plasmidien isäntäbakteerien tunnistaminen heterogeenisestä bakteeriyhteisöstä yksisolu-ddPCR-menetelmän avulla

Abstract

Antibioottiresistentit bakteerit ovat yksi tämän päivän suurimmista haasteista niiden horjuttaessa nykyaikaista terveydenhoitoa, ja ongelman ratkaisemiseksi tarvitaankin uudenlaisia lähestymistapoja. Eräs potentiaalinen vaihtoehto on CRISPR-Cas9-systeemiin pohjautuvat geneettiset työkalut, jotka voidaan ohjelmoida katkaisemaan antibioottiresistenssin tuottava geeni, ja näin ollen poistaa bakteerin vastustuskyky antibiootille. Bakteerisoluille soveltuvia yksisolumenetelmiä on kehitetty bakteeriyhteisöjen tutkimiseksi yhden solun tarkkuudella. Nämä menetelmät mahdollistavat tietyn geenin isäntäbakteerien tunnistamisen fuusio-PCR:n avulla, jossa taksonominen markkerigeeni (16S rRNA) liitetään tutkittavaan geeniin. Tässä työssä käytettiin yksisolu-ddPCR-menetelmää (Droplet Digital PCR) konjugaation avulla liikkuvan CRISPR-Cas9-plasmidisysteemin (cas9) ja blaCTX-M-15 resistenssigeenin kantajien tunnistamiseen bakteeripopulaatiossa. Aluksi kartoitettiin fuusio-PCR-reaktiolle suotuisat olosuhteet, jonka jälkeen blaCTX-M-15 ja cas9 -geenien kantajat sekä mahdollinen liikkuminen jäljitettiin yksinkertaisessa synteettisessä bakteeripopulaatiossa. Tulosten perusteella molempien geenien kantajat pystyttiin tunnistamaan yhteisöstä yksisolumenetelmän avulla. Havaittiin myös, että CRISRP-Cas9-plasmidisysteemiä kantava Escherichia coli ei menestynyt hyvin, mutta bakteerien päivittäinen migraatio populaatioon auttoi pitämään sen osana yhteisöä. Tutkimustulosten avulla saatiin tietoa CRISPR-antimikrobiaalien tehokkuudesta heterogeenisessä bakteeriyhteisössä, jossa niiden toimintakykyyn vaikuttavat monitahoiset interaktiot.

Bacterial resistance is one of the biggest threats in the modern healthcare. To resolve this problem, new approaches are needed. One potential solution is genetic engineering tools based on CRISPR-Cas9 system, that can be directed to cut target antibiotic resistance genes, reducing antibiotic resistance. Recently, microbial single-cell methods have been developed for analyzing bacterial communities at single cell resolution. By utilizing fusion PCR reaction for combining taxonomic 16S rRNA marker gene with the gene of interest, the bacteria harbouring the target gene can be identified. In this study, single-cell method based on ddPCR (Droplet Digital PCR) was used to trace the dispersal of conjugative CRISPR-Cas9 plasmid system (cas9), and blaCTX-M-15 resistance gene in heterogenous bacterial population. First, optimized conditions for fusion PCR reaction were determined. Carriers of cas9 and blaCTX-M-15 genes, and the potential transfer within bacteria were detected in synthetic bacterial population. The results show that using single-cell method the carriers of these genes were identified in bacterial community. It was observed that in 7-day co-culture experiment, Escherichia coli delivery strain of CRISPR-Cas9 plasmid system did not survive, but daily migration into the population helped to maintain it as part of the community. These results provide knowledge of the efficiency of CRISPR-antimicrobials in heterogenous bacterial community, where complex interactions may affect their competence.