Antiviral study of synthetic molecules on enteroviruses

Abstract

Enterovirusten sukuun sisältyy suuri määrä viruslajeja, jotka aiheuttavat tyypillisesti lieviä flunssan oireita, mutta niiden tiedetään myös johtavan vakavampiin akuutteihin ja kroonisiin tulehduksiin. Ne on myös yhdistetty tyypin 1 diabetekseen, sydänkohtauksiin ja aivohalvaukseen sekä aiheuttavat enterorokko-epidemioita. Toistaiseksi enteroviruksia vastaan ei kuitenkaan ole saatavilla viruslääkkeitä, minkä vuoksi ne ovatkin tärkeä lääkkeiden ja rokotteiden kehityskohde. Tässä tutkimuksessa 201 synteettistä molekyyliä seulottiin mahdollisen antiviraaliefektin selvittämiseksi ja näin valikoitujen yksilöiden inhibiitiokykyä ja mekanismia analysoitiin pidemmälle. Seulonnat suoritettiin infektoimalla soluja Coxsackievirus A9:llä ja Coxsackievirus B3:lla molekyylien läsnäollessa, minkä jälkeen infektion inhibitiota arvioitiin kristalliviolettivärjäyksellä ja absorbanssimittauksilla. Konsentraatiosarjojen avulla tutkitut molekyylit rajattiin kolmeen kaikkein potentiaalisimpaan, joista kaksi oli erityisen kiinnostavia niiden inhibitiokyvyn ja alhaisen toksisuuden ansiosta. Jotta pystyttiin muodostamaan kuva molekyylien inhibiitiomekanismista, tehtiin useita kokeita, jotka keskittyivät erityisesti viruskapsidiin kohdistuvien vaikutusten selvittämiseen. Kokeisiin kuului ’time-of-addition’, ‘uncoating’ ja radioaktiivinen gradienttikoe ja lisäksi molekyyleillä käsiteltyjä viruksia kuvannettiin elektronimikroskoopilla. Tulokset viittaavat siihen, että molekyylikäsittelyn jälkeen viruskapsidi säilyy ehjänä, viruksen kapsidin avautuminen vähenee ja optimaalisen inhibition saamiseksi riittää, että molekyyli on läsnä ennen viruksen lisäämistä soluille. Näiden perusteella on todennäköistä, että nämä kolme molekyyliä sitoutuvat viruskapsidiin, stabiloivat sitä ja sen myötä estävät virusgenomin vapautumisen. Löydetyt molekyylit ovat mielenkiintoisia kohteita lisätutkimuksille muun muassa niiden rakenteen ja mahdollisten sitoutumiskohtien yhteyden selvittämisen saralla. Tulevaisuudessa myös toimivuus muita enterovirusserotyyppejä vastaan on mielekästä tutkia. Kaiken kaikkiaan erityisesti kaksi molekyyleistä ovat hyviä kohteita jatkotutkimuksille ja mahdolliselle antiviraalilääkekehitykselle. Molekyylit antavat myös arvokasta tietoa, jota voidaan käyttää uusien synteettisten molekyylien suunnitteluun.

The enterovirus genus consists of a number of virus species which are known to cause diseases that range from mild flu to more serious acute and chronic inflammations, yet they lack available antivirals. The viruses are also associated with type 1 diabetes, heart attack and acute stroke and have been the cause of hand, foot and mouth epidemics which makes enteroviruses a very just target for antiviral as well as vaccine development. In this study, 201 synthetic molecules were screened for antiviral activity and those showing potential were further studied to examine their inhibition mechanism and efficacy. Initial screenings were performed by infecting cells with Coxsackievirus A9 and Coxsackievirus B3 in the presence of the synthetic molecules after which inhibition was analysed with crystal violet staining and absorbance measurements. The molecules were narrowed down to the three most potential ones with concentration series, two of them being particularly interesting due to good inhibition and low cytotoxicity. An idea of the possible inhibition mechanism was formed with a combination of time-of-addition assays, radioactive gradient assay, uncoating assay and imaging of the viruses with transmission electron microscopy. Results indicated that the virus capsid remains intact after molecule treatments, the molecules reduce viral uncoating and, to get effective inhibition, the presence prior to adding the virus onto cells is enough. Thus, it was concluded that two of the discovered potential antivirals likely bind to the virus capsid, stabilize it and, in doing so, prevent the virus from releasing its genome. The molecules are attractive for further research of the molecule structures, analysis of potential binding sites and possible tests with other enterovirus serotypes to asses broad spectrum effectiveness. These molecules could be considered for antiviral drug development or at the least give valuable information which can be used to design new synthetic molecules with even more effective structures.