Verifying the presence of voltage gated sodium channels in retinal pigment epithelium

Abstract

Verkkokalvon pigmenttiepiteeli (eng. retinal pigment epithelium eli RPE) on välttämätön kudos näkökyvylle. RPE toimii esteenä verenkierron ja verkkokalvon välillä, huoltaa valoreseptorisoluja mm. kuljettamalla ravinteita ja absorboimalla haitallista, siroavaa valoa, sekä avustaa näköaistimuksessa. RPE:n toiminnan heikentyminen saattaa johtaa verkkokalvon rappeumaan sekä lopulta näkökyvyn menettämiseen. Ionikanavien rooli on merkittävä verkkokalvon pigmenttiepiteelin normaalille toiminalle. Tässä työssä tutkittiin RPE:n jänniteherkkiä natriumkanavia (eng. voltage gated sodium channels eli NaV); tavoitteena oli vahvistaa erilaisten jänniteherkkien natriumkanavien alayksiköiden esiintyminen verkkokalvon pigmenttiepiteelissä kuvantamisen keinoin sekä eristämällä niitä RPE-soluista ja todentaa ne Western blot -menetelmällä. Aluksi kaikki yhdeksän NaV –alayksikköä värjättiin sopivilla vasta-aineilla ja kuvattiin konfokaalimikroskoopilla. Ne alayksiköt, jotka havaittiin mikroskoopilla, oli määrä eristää RPE-soluista ja edelleen tutkia Western blot –menetelmän avulla. Ainoastaan NaV1.4, NaV1.5, NaV1.6 ja NaV1.8 voitiin luotettavasti havaita vasta-aineleimatuista solunäytteistä mikroskoopilla. Nämä em. jänniteherkän natriumkanavan alayksiköt valittiin siis jatkokäsittelyihin. Ennen varsinaista eristämistä ja NaV-alayksiköiden olemassaolon vahvistamista, sopivin kalvoproteiinien eristysmenetelmä sekä tähän tarkoitukseen soveltuva Western blot –protokolla oli testattava ja optimoitava. NaV-proteiinien eristyksessä paras saanto saatiin radioimmunosaostuksen määrityspuskuri (RIPA), proteaasi-inhibiittoreiden ja etyleenidiamiinitetraetikkahapon (EDTA) yhdistelmällä. Eristetyt kalvoproteiinit eroteltiin toisista proteiineista SDS- geelielektroforeesin avulla, siirrettiin sähkövirran avulla nitroselluloosakalvolle ja lopuksi värjättiin sopivilla vasta-aineilla. Tutkimuksissa varmistui edelleen, että RPE solut selvästi ilmentävät NaV1.4, NaV1.5 ja NaV1.6 alayksiköitä. Tulokset viittasivat vahvasti siihen, että RPE ilmentäisi myös alayksikköä 1.8, mutta tämän kohdalla Western blot –tulokset eivät olleet yhtä selkeitä kuin muilla alayksiköillä. NaV1.8 luotettava todentaminen vaatii siis vielä työtä ja mahdollisesti protokollien uudelleen optimointia.

The retinal pigment epithelium (RPE) is an important tissue for vision. It functions as a barrier between retina and blood circulation but also takes care of the light sensing cells of the retina cells and aids with vision. The loss of different functions in RPE has been linked with retinal dysfunction and degeneration which can finally lead to the loss of vision. Ion channels have been discovered to be very important for the normal function of RPE and for visual health. The aim of this study was to verify the presence of different voltage gated sodium channel subunits (NaV) in RPE. All nine NaV subunits (NaV1.1-1.9) were assayed with suitable fluorescent antibodies from RPE cells and the results were examined with confocal microscopy. Only four NaV subunits, NaV1.4, NaV1.5, NaV1.6 and NaV1.8, were visibly abundant in the RPE cells. These NaV subunits needed to be extracted and immunoblotted. Before the verifications, the protocols for membrane protein extraction and immunoblotting were developed and optimised. The best extraction results were obtained with a combination of radioimmunoprecipitation assay buffer (RIPA), protease inhibitor cocktail and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). The extracted sodium channel subunits were separated from other proteins with SDS gel electrophoresis, transferred into a nitrocellulose membrane and finally stained with suitable antibodies. Taken together, the results verified the presence of NaV1.4, NaV1.5 and NaV1.6 subunits in RPE cells. The NaV1.8 was only slightly visible in the blots, so the existence could not be confirmed. However, all the results indicate that the RPE also expresses the NaV1.8 subunit, but this still requires some additional work.