Primary sclerosing cholangitis dysplasia-carcinoma sequence : possibilities in early stage molecular pathology

Abstract

Primaarinen sklerosoiva kolangiitti, eli PSC on krooninen tulehduksellinen sappiteiden sairaus, joka aiheuttaa sappiteihin arpeutumista ja ahtaumia. PSC potilaista 20 % saa pelättynä huonoennusteisena komplikaationa sappitiesyövän eli kolangiokarsinooman. Kolangiokarsinooman katsotaan kehittyvän kroonisen tulehduksen aiheuttamien sappiteiden muutosten, sekä DNA-vaurioiden seuraksena. Taudin kehityskulku on vaiheittainen, jossa sappiteiden epiteelisolujen syövän esiasteet, eli dysplasiat edeltävät syövän syntymistä. Ainoa parantava hoito kolangiokarsinoomaan on maksansiirto, joka tulisi suorittaa oikea-aikaisesti jo ennen syövän kehittymistä. On haastavaa erottaa toisistaan hyvänlaatuiset sappiteiden ahtaumat ja syöpäsolukko. Edes erilaisia diagnostisia menetelmiä yhdistämällä ei saada kolangiokarsinoomaa havaittua tarpeeksi ajoissa, jotta maksansiirron ajankohta voidaan optimoida. Käytössä on kuvantamisen menetelmiä, sytologiaa ja erilaisia biomarkkereita, mutta niidenkin yhdistelmillä on haastavaa havaita kolangiokarsinooman kehittyminen varhaisessa vaiheessa. Kolangiokarsinoomassa tyypillisesti esiintyviä geneettisiä muutoksia on löydetty useista geeneistä, kuten KRAS-, TP53-, FBXW7-, CDKN2A- ja SMAD4 -geeneistä. Nykytekniikoilla, kuten uuden sukupolven sekvensoinnilla (NGS), sekä emulsiopohjaisella digitaalisella polymeraasiketjureaktiolla (ddPCR) mutaatioita voidaan tutkia erilaisista näytteistä. Tässä työssä tutkimme neljään eri kategoriaan (ei dysplasiaa, lievä dysplasia, vaikea dysplasia ja kolangiokarsinooma) kuuluvia syöväksi edenneitä näytteitä vuosilta 2007-2018 ja pyrimme löytämään kolangiokarsinooman tunnettuja mutaatioita näistä näytteistä NGS- ja ddPCR -menetelmillä. Emme löytäneet tiettyä kolangiokarsinooman syntyä ennustavaa yhteistä muutosta näytteistä, mutta tuloksissa oli monia kiinnostavia mahdollisesti tautia aiheuttavia geenivariantteja. Aiempien tutkimusten perusteella odotimme löytävämme KRAS-mutaatioita näytteistä, mutta vain muutama näyte oli KRAS-mutaatiopositiivinen NGS-menetelmällä. Näytteiden ikä, sekä pienet DNA saannot näytemateriaalista näyttivät vaikuttavan sekvensointituloksiin negatiivisesti. ddPC oli herkempi menetelmä ja osoitti KRAS-mutaatioita useista näytteistä. Kolangiokarsinoomaan johtavien aikaisten muutosten tutkiminen on tärkeää ja parempilaatuisesta alkumateriaalista geenimuutosten löytäminen voi onnistua paremmin.

Primary sclerosing cholangitis (PSC) is a chronic inflammatory disease of the liver and it causes fibrosis and strictures in the bile ducts. Cholangiocarcinoma (CCA) is the most significant cause of early death in PSC patients and 20 % of the patients will develop CCA as a complication of PSC. Pathogenesis of PSC associated CCA is believed to be driven by the chronic inflammation of PSC. DNA damages lead to CCA through dysplasia-carcinoma sequence. CCA is a cancer with poor prognosis and only curative treatment is liver transplantation (LT) on early stage. It is challenging to distinguish benign PSC lesions from premalignant or malignant even with various combinations of diagnostic methods such as computed tomography, magnetic imaging, endoscopic retrograde cholangiography, brush cytology, flow cytometry and different biomarkers. Early diagnostic methods for surveillance of malignancy in PSC patients is much needed. Genetic alterations in PSC associated CCA such as KRAS, TP53, FBXW7, CDKN2A and SMAD4 have been found in CCA tumors. Mutations can be studied with sensitive methods like next generation sequencing (NGS) and droplet digital PCR (ddPCR). In this work the aim was to study FFPE brush cytology samples from PSC patients in four categories (no dysplasia, low-grade dysplasia, high-grade dysplasia and CCA) where the end result had been CCA in between years 2007 to 2018. The goal was to study with NGS and ddPCR if CCA linked mutations could be found in dysplasia samples to predict the development of CCA. No clear cancer predictive marker variants were found in the NGS data but multiple pathogenic or possibly pathogenic variants were present. We hypothesized to find KRAS mutations in the samples since they are very frequent in CCA tumours. However due to the low DNA yields and the age of the samples only a few samples tested positive for KRAS. ddPCR had higher sensitivity for detecting KRAS from these scarce samples. More research with better sample quality is needed to study these variants that can be detected already in dysplasia stages.