Extended-spectrum β-lactamase-producing Enterobacteriaceae: risks during antibiotic treatment and potential solutions to cure carriage

Abstract

The abundant consumption and negligent use of antibiotics have resulted in the global emergence of antibiotic-resistant bacteria. This is largely due to the rapid spread of multi-resistance plasmids in bacterial communities via conjugation. The increased carriage of extended-spectrum β-lactamase (ESBL)-producing Enterobacteriaceae in the human gut increases the probability of conjugative ESBL plasmids spreading to new bacterial hosts. Therefore, identifying factors that affect the dispersal of plasmids is essential to control their spread. In this thesis, I demonstrate that bacteria-harbouring ESBL plasmids can evolutionarily rescue antibiotic-susceptible cells in a bacterial community via conjugation even under lethal β-lactam concentrations. Thus, antibiotic-sensitive pathogens may also become resistant after an apparently efficient treatment is initiated. In this thesis, a conjugative clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 plasmid system (i.e., midbiotics) was developed to eradicate sequence-specifically different ESBL-bacteria from bacterial community, such as gut microflora. Several genes can be targeted simultaneously with a single midbiotic plasmid. The dispersal of the midbiotic plasmids results in efficient resensitisation of the exposed strains to β-lactams. However, before introducing this system in vivo, the following concerns need to be resolved: the dissemination of unwanted genes in the flora, mutations that nullify CRISPR activity, and the spread of the conjugative plasmid without its ESBL-targeting plasmid partner. In addition to midbiotics, lytic phages, which infect and kill resistant bacterial pathogens, may provide a potential option to decrease ESBL carriage. In this thesis, it was demonstrated that phages can be isolated on-demand from environmental reservoirs to carry out personalised phage therapy against Enterobacteriaceae, which are frequently associated with ESBL infections. Keywords: Antibiotic resistance; horizontal gene transfer; conjugative plasmids; bacteriophages; phage therapy; CRISPR-Cas9.

Runsas ja huolimaton antibioottien kulutus on johtanut antibioottiresistenttien bakteerikantojen globaaliin kasvuun. Pääosin tämä johtuu moniresistenssi plasmidien nopeasta leviämisestä bakteeriyhteisössä konjugaation avulla. Lisäksi laajakirjoisia β-laktamaaseja (ESBL) tuottavien enterobakteerien yleistyminen ihmisten suoliston normaalifloorassa mahdollistaa konjugatiivisten ESBL-plasmidien leviämisen uusiin bakteeri-isäntiin. Kontrolloidaksemme näiden plasmidien leviämistä, on tärkeää selvittää tekijöitä, jotka vaikuttavat leviämiseen. Tässä väitöskirjassa esitän, kuinka bakteerit voivat evolutiivisesti pelastaa bakteeriyhteisön antibiooteille alttiit bakteerit jopa letaalissa β-laktaami konsentraatiossa konjugoimalla ESBL-plasmidin näihin soluihin. Näin ollen jopa tehokas antibioottihoito ei välttämättä estä antibioottisensitiivisten patogeenien muuntumista resistenteiksi. Lisäksi näytän, kuinka kehittämäni geenisaksia (CRISPR-Cas9) koodaava konjugatiivinen plasmidisysteemi (nim. midbiotic) tuhoaa sekvenssispesifisesti erilaisia ESBL-plasmideja bakteeriyhteisöstä. Yhdellä plasmidilla pystytään kohdentamaan useita eri resistenssigeenejä samanaikaisesti ja lopputuloksena bakteerit muuntuvat jälleen alttiiksi β- laktaameille. Tätä menetelmää voisi hyödyntää esimerkiksi hävittämään resistenssigeenejä suolistofloorasta. Ennen midbioticin käyttöönottoa in vivo, menetelmää tulee kehittää niin, että epäsuotuisten geenien leviäminen ja midbiotic-plasmidien erillinen leviäminen estetään. Myös geenisaksien tehokkuutta alentavien mutaatioiden vaikutusta tulee vähentää. Vaihtoehtoisesti ESBL-kantajuuden poistamiseksi voitaisiin käyttää bakteereita infektoivia ja tappavia lyyttisiä faageja. Tässä väitöskirjassa osoitan, että tarvittaessa faageja voidaan eristää ympäristöstä ESBL-infektioihin liitetyille enterobakteereille ja valmistaa yksilöllinen faagikoktaili faagiterapiaa varten. Avainsanat: antibioottiresistenssi; horisontaalinen geenin siirto; konjugatiiviset plasmidit; bakteriofaagit; faagiterapia; CRISPR-Cas9.