Immunoprecipitation of sirt1, sirt3 and PGC-1A from rat gastrocnemius and soleus with magnetic beads

Abstract

Paajala J. 2017. Sirt1-, sirt3- ja PGC-1α-proteiinien immunopresipitaatio rotan gastrocnemius- ja soleuslihaksesta magneettien avulla. Liikuntatieteellinen tiedekunta, Jyväskylän yliopisto, liikuntafysiologian pro gradu -tutkielma, 70 s.

Sirt1-, sirt3- ja PGC-1α-proteiinit säätelevät muun muassa solujen mitokondrioiden määrää ja toimintaa. Koska metabolisen oireyhtymän sairaudet ovat yhteydessä mitokondrioiden vajaatoimintaan, on näiden proteiinin biologisen merkityksen tunteminen tärkeää. Tutkimuskäyttöä varten on jalostettu syntyperältään heikon (low capacity runner rat, LCR) ja korkean (high capacity runner rat, HCR) juoksukyvyn omaavat rottakannat, joiden yksilöt eroavat toisistaan terveydentilaltaan. HCR/LCR -mallin avulla voidaan tutkia, kuinka aineenvaihduntaan osallistuvien entsyymien toiminta eroaa terveillä ja sairailla yksilöillä.

Tässä tutkimuksessa selvitettiin magnetiikkaan perustuvan immunopresipitaation avulla sirt1-, sirt3-, PGC-1α-, GAPDH- ja tubulin-proteiinien eristystä. HCR-rotan homogenoituun lihasnäytteeseen lisättiin ensin kohdeproteiinit tunnistavat vasta-aineet. Sen jälkeen lisättiin vasta-aineisiin tarttuvat magneetit. Vaihtoehtoisesti ensin kiinnitettiin magneetit ja vasta-aine, minkä jälkeen lisättiin homogenaatti. Seuraavana päivänä magneetit kerättiin liuoksesta ja ne puhdistettiin siten, että magneettiin kiinnittynyt vasta-aine ja kohdeproteiini irtosivat magneetista. Kohdeproteiini analysoitiin Western blot -menetelmällä.

Tulosten mukaan sirt1-, sirt3-, PGC-1α-, tubulin ja GAPDH-proteiineja ei pystytty eristämään tutkimuksessa käytettyjen menetelmien avulla. Immunopresipitaatiossa käytetty vasta-aine irtosi magneetista kohdeproteiinin mukana Western blot -analyysiin, jossa se häiritsi kuvantamista. Toinen ongelma oli se, että vasta-aine ei tarttunut kiinni kohdeproteiiniinsa tai magneetti ei tarttunut vasta-aineeseen. Sen seurauksena osa kohdeproteiineista peseytyi immunopresipitaation aikana pois. Western blot -menetelmällä PGC-1α-proteiinia ei havaittu.

Muokkaamalla menetelmän olosuhteita, kuten puskureiden pH-arvoja ja vaihtamalla käytettäviä vasta-aineita, menetelmä saataneen onnistumaan. Lisäksi erilaisia vasta-aineen ja magneetin kiinnittämistapoja on syytä kokeilla, sillä vasta-aineen ja magneetin väliin laitettavalla sitojakomponentilla voitaneen estää vasta-aineen pääseminen kohdeproteiinin mukana Western blot -analyysiin. Puhdistetun proteiinin käyttäminen positiivisena kontrollina on tärkeää tulosten varmistamiseksi, mutta tässä tutkimuksessa sitä ei ollut käytettävissä.

Paajala, J. 2017. Immunoprecipitation of sirt1, sirt3 and PGC-1α from rat gastrocnemius and soleus with magnetic beads. The Faculty of Sport and Health Sciences, University of Jyväskylä, Master’s Thesis, 70 pp.

Sirt1, sirt3 and PGC-1α are proteins that regulate among other factors the function and number of mitochondria. Understanding the biological function of these proteins is important, because risk factors and symptoms related to metabolic disorders are associated with poorly regulated mitochondrial function. Enzymatic differences between healthy and unhealthy individuals have been studied by using high capacity running/low capacity running rats contrasting model system.

The aim of the study was establish a method to isolate sirt1, sirt3 and PGC-1α from gastrocnemius and soleus muscle samples of high capacity running rat by immunoprecipitation using magnetic beads. In addition, GAPDH and tubulin were investigated to validate the method further. The antibodies were incubated with the magnetic beads followed by incubation with homogenized muscle samples. Alternatively, antibodies and homogenized samples were incubated first followed by incubation with the beads. Next day, the beads were collected and the target proteins were eluted from the beads. The target proteins were analyzed using Western blot.

The results showed that sirt1, sirt3, PGC-1α, tubulin and GAPDH could not be isolated and detected with the protocols described in this study. One issue was that antibodies used in immunoprecipitation co-eluted to the Western blot analysis interfering the imaging of the target protein. Second issue was the failure of the antibodies to bind to their target proteins or that antibodies did not attach to the magnetic beads and therefore some target proteins were washed away during immunoprecipitation. In Western blot, PGC-1α was not detected at all.

By optimizing the conditions of the protocol, such as pH of buffers or changing antibodies, one might be able to isolate the target proteins. In addition, by using a crosslinking component between the antibody and the beads, co-elution of antibody to the Western blot analysis might possibly be avoided. To verify the results, the use of purified protein as a positive control is important, but in this study it was not available.