Novel small molecule in differentiation of hiPSC derived cardiomyocytes and single cell beating analysis

Abstract

Sydäntaudit ovat johtava kuolinsyy maailmanlaajuisesti, ja siksi potilasspesifisien lääketestausmallien sekä kudosregeneraation tutkimus on ajankohtainen aihe. Nykyinen teknologia ei pysty vielä tuottamaan suuria määriä puhtaita ihmisen indusoiduista pluripotenteista kantasoluista (hiPSC) erilaistettuja sydänsoluja tarpeeksi tehokkaasti, jotta niitä voitaisiin käyttää regeneratiivisessa lääketieteessä ja luotettavammassa lääketestauksessa. Sydänsolujen tuottamista ja karakterisointia täytyy kehittää. Tämän tutkimuksen tavoite oli jatkaa potilasspesifisten hiPSC sydänsolujen erilaistamisen karakterisoimista ja testata oletetun sydänsolujen erilaistusta tehostavan pienmolekyylin (PCDE) vaikutusta erilaistamisen tehokkuuteen. Hypoteesi oli, että kyseinen pienmolekyyli parantaisi erilaistustehokkuutta. Erilaistustehokkuutta mitattiin virtaussytometrisesti sydänmarkkerilla, Troponiin T:llä, ja kardiomyosiitit karakterisoitiin immunovärjäyksillä sekä kvantitatiivisen polymeraasiketjureaktion (qPCR) avulla. Geeniekspressiota analysoitiin RNA-näytteistä erilaistuksen eri vaiheista. Tutkimuksen aikana arvioitiin tekniikkana videopohjaista yksittäisten solujen sykeanalyysia, joka on tietokoneohjelmaan pohjautuva tukeva tutkimusmenetelmä yksittäisten solujen sykekuvion määrittämiseksi. Tuloksiin perustuen PCDE ei onnistunut tehostamaan hiPSC sydänsolujen erilaistamista ja saattoi vähentää sydänmarkkereiden ekspressiota. Totesimme kuitenkin, että videopohjaista sykeanalyysiä voitaisiin käyttää yhdessä yksittäisten solujen PCR-tutkimusten kanssa sydänsolujen paremman karakterisoinnin saavuttamiseksi.

Cardiac disease remains the leading cause of death in the world. Therefore, the need for patient specific drug testing models, as well as tissue regeneration, are hot topics in medicine. The modern technology is still unable to efficiently produce pure cultures of human induced stem cell (hiPSC) derived cardiomyocytes, which are needed for several purposes including regenerative medicine and reliable drug testing for cardiac disease. Further development of hiPSC derived cardiomyocyte differentiation and characterization techniques is required. The objective of this experiment was to further characterize the differentiation of hiPSC derived cardiomyocytes obtained from patients and to test the effects of a novel putative cardiac differentiation enhancing small molecule (PCDE), on the efficiency of differentiation. The hypothesis was that the small molecule would increase the differentiation efficiency. The efficiency was tested with flow cytometry using a cardiac marker, Troponin T, and the cardiomyocytes were characterized by immunostaining and quantitative polymerase chain reaction (qPCR). Gene expression was analyzed from RNA samples collected from different time points of differentiation. During the experiment video-based beating analysis, a robust technique that utilizes a computer program to characterize beating patterns of single cardiomyocytes, was evaluated as a technique. Based on all results PCDE failed to enhance the differentiation efficiency of hiPSC derived cardiomyocytes and may have reduced the expression of cardiac markers. However, we found that the video based beating analysis could be used in combination with single cell PCR to better characterize cardiomyocytes.