Dielectrophoretic trapping and Raman spectroscopy of fluorescent oligonucleotides

Abstract

Nanotiede kasvaa edelleen tutkimusalana nopeasti, ja sille löytyy lukematon määrä sovelluskohteita. Sen vahvuutena on poikkitieteellisyys fysiikan, kemian ja biologian kesken, jotka kaikki tutkivat atomitason ilmiöitä. Näiden ilmiöiden tutkiminen ja soveltaminen vaatii paljon erilaisia, sofistikoituneita menetelmiä ja työkaluja, joilla voidaan valmistaa ja karakterisoida erilaisia nanopartikkeleita ja -rakenteita. Joissain tapauksissa vaaditaan jopa yksittäisten molekyylien tai atomien manipulointia nanometritasolla.

DNA on yksi mielenkiintoisista nanotieteen tutkimuskohteista. Se on elämän kannalta merkittävä molekyyli, sillä se pitää sisällään elävän organismin rakenteellisen ohjeen. DNA:n tärkeä rooli proteiinisynteesissä vaatii sen olevan kemiallisesti erittäin vakaa ja tarkasti hallittava. Nämä ominaisuudet tekevät siitä monipuolisen ja tärkeän tutkimuskohteen. DNA:n itsejärjestyvyysominaisuuksien takia sen käyttöä erilaisina ohjelmoitavina rakennuspalikoina ja tukirakenteina on tutkittu innokkaasti. Pii-pohjaisen mikro- ja nanopiiritekniikan suorituskyvyn lähestyessä fysikaalisia rajojaan myös DNA:n sähkönjohtavuutta on tutkittu mahdollisten nanoelektroniikkaan liittyvien sovellusten takia.

DNA:n hyödyntämisen mahdollistaa sen muokattavuus. DNA-oligonukleotidit ovat synteettisiä, yleensä muutaman kymmenen emäsparin pituisia yksijuosteisia DNA-molekyylejä, joihin voi valita mieleisensä sekvenssin sovelluskohteen mukaan. Molekyylin molempiin päihin on myös mahdollista liittää erilaisia funktionaalisia molekyylejä. Tämä ominaisuus on hyödyllinen erityisesti biotieteissä, joissa hyödynnetään paljon fluoresenssimikroskopiaa. Koska näytteet eivät aina ole itsessään fluoresoivia, ne täytyy tarvittaessa leimata tilanteeseen sopivilla merkkiaineilla. Lisäksi koejärjestelystä riippuen voidaan tarvita esimerkiksi erilaisia linkkeri-molekyylejä.

Erilaisten molekulaaristen modifikaatioiden käyttöön kuvantamisessa liittyy kuitenkin se heikkous, että ne lisäävät näytteiden monimutkaisuutta ja hintaa. Siten kuvantamistekniikat, joiden käyttö ei vaadi erillisiä merkkiaineita, voivat joissain tapauksissa olla suureksi hyödyksi. Raman-spektroskopia, esimerkiksi, perustuu sähkömagneettisen säteilyn Raman-sirontaan fluoresenssin sijaan. Intialaiset fyysikot C. V. Raman ja K. S. Krishnan todistivat sen olemassaolon 1920-luvun alussa. Valo voi elastisen Rayleigh-sironnan lisäksi sirota Ramanaktiivisista partikkeleista epäelastisesti. Raman-moodeja on kaksi, joita kutsutaan Stokes- ja anti-Stokes-siirtymiksi. Stokes-siirtymässä systeemi siirtyy perustilalta virtuaalitilan kautta vibraatiotilalle. Siten sironneen fotonin energia on pienempi alkutilanteeseen verrattuna. Anti-Stokes-siirtymässä tapahtuu päinvastoin, jolloin fotonin loppuenergia on alkuperäistä suurempi. Raman-spektroskopiaa voidaan pitää ideaalisena menetelmänä biotieteissä, koska aineen Ramanspektri on ikään kuin sen uniikki sormenjälki.

Nanopartikkelien manipulointi onnistuu esimerkiksi hyödyntämällä dielektroforeesia, jonka teorian Herbert A. Pohl esitti jo 1950-luvulla. Ilmiö tarkoittaa neutraalien tai varattujen, polarisoituvien hiukkasten indusoitua liikettä epä-homogeenisessa sähkökentässä. Esimerkkinä voi käyttää sähköistä dipolia, joka voi olla pysyvä tai indusoitu. Dipoli asettuu sähkökenttään sen kenttäviivojen mukaisesti. Kentän gradientin takia Coulombin vuorovaikutuksen suuruus dipolin eri päissä poikkeaa toisistaan, mikä johtaa nettovoimaan ja liikkeeseen kentän gradientin mukaisesti. Mikäli partikkelin sähköinen permittiivisyys on väliaineen permittiivisyyttä suurempi, liikkuu se kohti kentän maksimia, jolloin puhutaan positiivisesta dielektroforeesista. Negatiivisesta dielektroforeesista puhutaan vastaavasti silloin, kun väliaineen sähköinen permittiivisyys ylittää partikkelin permittiivisyyden. Silloin partikkeli liikkuu kohti kentän minimiä.

Tässä työssä fluoresoivalla merkkiaine-molekyylillä ja tioli-ryhmällä varustettuja, neljänkymmenen emäsparin pituisia DNA oligonukleotideja vangittiin dielektroforeesin avulla kullasta valmistettujen, sadan nanometrin levyisten elektrodien väliin, jonka jälkeen näytteitä tarkasteltiin konfokaalisilla, laseriin perustuvilla fluoresenssi- ja Raman-mikroskoopeilla. Elektrodikuvio, jossa oli useita elektrodipareja, valmistettiin elektronisuihkulitografialla ja itse elektrodit elektronisuihkuhöyrystimellä. Puolijohdenäytteet tutkittiin pyyhkäisyelektronimikroskoopilla valmistusvirheiden varalta. Fluoresenssimikroskopilla varmistettiin oligonukleotidien vangitsemisen onnistuminen. Raman-spektroskopian tarkoituksena oli tutkia, voisiko sen yhdistää dielektroforeesin kanssa, jolloin lopputuloksena voisi olla suhteellisen yksinkertainen, merkkiaineeton, alle mikrometrimittakaavassa toimiva kuvantamismenetelmä, jota voi käyttää lokalisoitujen näytteiden tutkimiseen. Tutkittavien partikkeleiden keräämisellä yhteen pisteeseen, niiden tutkiminen helpottuu, mikäli konsentraatio muuten jäisi alhaiseksi. Samalla voisi yrittää selvittää partikkelien määrää. Fluoresenssimikroskooppikuvien laatu ei vastannut odotettua, mikä johtui lasereiden heikentyneestä kohdistuksesta. Riittävää Raman-spektriä ei onnistuttu mittaamaan, ainoa signaali saatiin näytteen piialustasta. Mittauksen haasteellisuus tiedettiin ennakkoon, koska käytetyn mikroskoopin spatiaalinen tarkkuus oli ainakin mikrometriluokassa, mutta ei välttämättä sadoissa nanometreissä.

The purpose of this study was to see if 40 bp poly-CT DNA oligonucleotides modified with a thiol group and a Cy3 dye molecule trapped on a silicon oxide surface using dielectrophoresis could be detected under a Raman microscope. Obtaining a clear Raman signal proved to be challenging though and in the end the only peaks visible in the Raman spectra were those originating from the silicon substrate. There were problems with the confocal fluorescence microscope too. The bad alignment of its lasers made the task of acquiring proper images rather difficult. The spatial resolution of the Raman setup was known to be in the micron scale at least but not probably extending to hundreds of nano metres. Therefore the result was somewhat expected. A successful Raman detection would have been a positive note in the search of label free imaging techniques for biosciences.