Generation and utilisation of natural product library for bioactivity screening and drug discovery

Abstract

Uusia lääkkeitä tarvitaan jatkuvasti. Koska luonnonaineet sisältävät bioaktiivisia yhdisteitä ja uusia kemiallisia rakenteita, ne tarjoavat lähes rajattoman uusien lääkeaineiden lähteen. Bioaktiivisuusseulontaan soveltuvan luonnonainekirjaston luomisen avulla voidaan luonnonaineisiin perustuvaa lääkekehitystutkimusta tehostaa lyhentäen prosessin normaalisti vaatimaa aikaa. Tässä työssä perustettiin luonnonaine (LA) kirjastojärjestelmä Lääkkeen keksintä- ja kehitysteknologian keskukselle (DDTC), joka on monitieteinen tutkimusyksikkö Helsingin yliopiston farmasian tiedekunnassa. Kokeellinen LA-kirjasto, joka sisältää sekä näytemateriaalia että tietokannan, perustettiin kesällä 2000 satunnaisen lajivalinnan perusteella kerätyistä 40:stä suomalaisesta kasvista. Jokainen kasvi oli alun perin joko kokonaisena tai jaoteltuna kahteen, neljään tai kuuteen kasvin osaan. Kasvin osista tuotetun kirjaston menetelminä olivat uutto (100% metanoli), kylmäkuivaus ja mikrofraktiointi käyttäen korkean erotuskyvyn nestekromatografiaa (HPLC; high-performance liquid chromatography). Näytteiden esiprofilointi tehtiin HPLC:lla, käyttäen käänteisfaasikolonnia ja gradienttieluutiota (metanoli-vesi, B% 5-95), yhdistettynä diodirividetektoriin ja mittaamalla absorbanssi kahdella aallonpituudella (A: λ 230 nm, B: λ 280 nm). Integrointia jatkossa tehtäviin bioaktiivisuusseulontoihin vahvistettiin luomalla tiedonhallintajärjestelmä Microsoft Access XP (2002) relaatiotietokantaan. Tuloksena oli 23 735 näytettä sisältävä 4-luokkainen LA-kirjasto (I-IV): (I) Kuivarohdokset, (II) Kuivauutteet, (III) Raakauutteet dimetyylisulfoksidiin (DMSO) liuotettuina, sekä (IV) Fraktioidut uutteet. Keskeisimpien näytteiden kokonaislukumäärät kirjastossa ovat luokassa I 145 kpl, luokassa II 145 kpl, luokassa III 145 kpl ja luokassa IV 23 300 mikrofraktiota 290:llä 96-kuoppaisella näytelevyllä. LA-kirjaston näytemateriaali säilytetään joko kuiva-olosuhteissa tai pakastettuna DDTC:n tiloissa, ja kirjaston tiedot ovat sekä tietokantatiedostoina (Microsoft Access) että soveltuvin osin tulostettuina erillisissä DDTC LA-kirjasto –kansioissa. Tietokantaan on tehty varaukset mahdollisille myöhemmin lisättäville luokille, jotka ovat (V) Luonnon puhdasaineet ja (VI) Synteettiset yhdisteet. Kontrolloitu ja helppokäyttöinen LA-kirjasto edistää sekä DDTC:n että mahdollisten yhteistyöosapuolten seulontatyötä, tarkoituksena löytää luonnonaineista bioaktiivisia yhdisteitä tai mahdollisten uusien lääkeaineiden alkurakenteita nopeammin säästämällä kokonaisprosessin aikaa. Microsoft Access tarjoaa käytännöllisen tietokannan sekä tiedon syöttämiseen, etsintään että muokkaamiseen. Kirjastoa voi myös laajentaa ja sinne voi lisätä monen tyyppistä lisätietoa tarpeen mukaan.

New drugs are needed continuously. Natural products offer almost unlimited source of bioactive compounds and novel chemical structures for new drugs. By creating natural product libraries suitable for bioactivity screening, drug discovery from natural products can be intensified with shortened timelines. In this work a natural product (NP) library system was generated for the Drug Discovery and Development Technology Center (DDTC) which is an interdisciplinary research unit belonging to the Faculty of Pharmacy at the University of Helsinki. The pilot NP library, including sample material and data base, was generated of 40 dried, randomly selected Finnish plants collected during the summer 2000. The plant samples were originally either whole plants or plants divided into two, four or six parts. Methods to produce the library material of plant parts were extraction (100% methanol), lyophilization and microfractionation by using the high-performance liquid chromatography (HPLC). The primary profiling was done by HPLC, using the reverse-phase column and gradient elution (methanol-water, B% 5-95) coupled with diode-array detection with two wavelengths (A: λ 230 nm, B: λ 280 nm). The integration of the NP library into further bioactivity screening was enhanced by creating a library data management system by using relational database, Microsoft Access XP (2002) software. The coding system was designed on the basis of the library classification and the nature of the samples. As a result, the 23 735-membered NP library consists of four classes (I-IV): (I) Crude natural product material, (II) Lyophilized crude natural product extracts, (III) Crude natural product extracts in DMSO, and (IV) Fractionated natural product extracts. Total pivotal quantity of sub-samples (the library material) in Class I was 145, in Class II 145, in Class III 145, and in Class IV 23 300 microfractions in 290 96-well microplates. The NP-library material samples are stored either in dry conditions or in a freezer in the facilities of DDTC, and the library data is in forms of created NP-library data base (Microsoft Access), and as a relevant data in separate DDTC-NP-Library binders. The NP-library database has a reservation for two additional classes (V: Natural compounds and VI: Synthetic compounds) which may be added later on. The controlled and easy-to-operate NP-library enables DDTC, and possible co-operative parties, to perform further screening processes for discovering bioactive compounds or lead structures of potential new drug candidates from natural products more rapidly by shortening the total process time. The Microsoft Access software offers practical platform for both entering, searching and modifying the data. The library can be expanded and several types of additional complex data can be added to the library data base whenever needed.