Show simple item record

dc.contributor.advisorKononen, Juha (LT)
dc.contributor.advisorLahtinen, Laura (FT)
dc.contributor.advisorYlänne, Jari (Prof., FT)
dc.contributor.authorIsomursu, Aleksi
dc.date.accessioned2015-04-14T19:28:51Z
dc.date.available2015-04-14T19:28:51Z
dc.date.issued2015
dc.identifier.otheroai:jykdok.linneanet.fi:1472165
dc.identifier.urihttps://jyx.jyu.fi/handle/123456789/45629
dc.description.abstractEpidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) monoklonaalisia vasta-aineita (mAb) käytetään apuna metastaattisen kolorektaalisyövän (mCRC) hoidossa. Aktivoivat mutaatiot KRAS- ja NRAS-onkogeeneissä tekevät syöpäsolut vastustuskykyisiksi anti-EGFR-vasta-aineille, ja tästä syystä tuumorit tulee genotyypittää ennen hoidon aloittamista. Kudosbiopsian ottaminen on kuitenkin invasiivinen toimenpide, eikä näyte välttämättä edusta kattavasti syövän kaikkien solupopulaatioiden geneettisiä muutoksia. Verenkierron solunulkoisen DNA:n (cfDNA) on havaittu sisältävän maligneista soluista lähtöisin olevia onkogeenisiä mutaatioita, ja se voi olla hyvä vaihtoehtoinen tuumoriperäisen DNA:n lähde. Kehitimme ja optimoimme lämpötilagradienttien ja laimennossarjojen avulla E-ice-COLD-PCR (engl. enhanced, improved and complete enrichment co-amplification at lower denaturation temperature PCR)-pohjaisen menetelmän plasman cfDNA:ssa esiintyvien KRAS-geenin kodonien 12 ja 13 mutaatioiden selektiiviseen monistamiseen; nämä mutantit vastaavat yhdessä noin 80 %:a kolorektaalisyövän kaikista RAS-mutaatioista. Monistetut mutantit osoitettiin mittaamalla PCR-tuotteista löytyvien alleelien määrät kohdennetun pyrosekvensoinnin avulla. 16:sta mCRC-potilaasta kerättiin 4x3 ml perifeeristä verta K2EDTA-putkiin. Sentrifugoinnin vaikutusta cfDNA:n eristämiseen ja sen jälkeiseen mutaatiomääritykseen arvioitiin erottelemalla plasma soluista neljän erilaisen sentrifugointiprotokollan mukaan: 10 min/500 x g; 10 min/500 x g + 10 min/16000 x g; 10 min/1600 x g; sekä 10 min/1600 x g + 10 min/16000 x g. cfDNA eristettiin plasmasta kaupallisilla piidioksidikalvopylväillä, ja näytteet joissa havaittiin vähiten kontaminoivaa genomista DNA:ta valittiin KRAS-mutaatiomääritykseen. Tuloksia verrattiin potilaiden tautimuutoksista aiemmin osoitettuihin mutaatioihin. Testin analyyttinen herkkyys KRAS-mutaatioita osoitettaessa oli 0,1 % (c.35G>A)-0,25 % (c.35G>C). Diagnostinen havaitsemisraja (LOD) oli vastaavasti 0,25 %-0,5 % (α = 0,05). cfDNA:ta oli potilaiden veressä keskimäärin 59 ± 50 ng/ml (x̄ ± sd), ja tulokset vastasivat tältä osin aiemmin julkaistuja tutkimuksia. Konsentraatio vaihteli sentrifugointiprotokollan mukaan (P = 0,022): 10 min 500 x g:llä erotellusta plasmasta eristettiin yleisesti ottaen hieman vähemmän cfDNA:ta kuin saman potilaan muista näytteistä. Kahdenvälisissä post-hoc-analyyseissä havaitut erot eivät kuitenkaan olleet tilastollisesti merkitseviä. Kun näytteistä määritettiin KRAS-mutaatioita, menetelmän herkkyys oli 17 % ja spesifisyys 89 %. E-ice-COLD-PCR-avusteinen kohdennettu pyrosekvensointi mahdollistaa KRAS-mutaatioiden c.35G>A ja c.35G>C herkän havaitsemisen pienestäkin määrästä DNA:ta. Vaikka testin tarkkaa suorituskykyä ei määritetty erikseen muilla KRAS-geenin kodoneissa 12 ja 13 esiintyvillä mutaatioilla (c.34G>T, c.34G>A, c.34G>C, c.35G>T ja c.38G>A), tämä on tarvittaessa helposti toteutettavissa. Testillä voidaan havaita patogeenisiä KRAS-mutaatioita myös mCRC-potilaiden cfDNA:sta, mistä voi olla hyötyä kun tavanomaisia kudosnäytteitä ei ole saatavilla tai kun halutaan suorittaa useita perättäisiä mutaatiomäärityksiä, esimerkiksi hankinnaisen resistenssin havaitsemiseksi. Diagnostisessa herkkyydessä todettujen puutteiden vuoksi testin kliininen validointi edellyttää kuitenkin kattavia, prospektiivisia jatkotutkimuksia.fi
dc.description.abstractAnti-epidermal growth factor receptor (EGFR) monoclonal antibodies (mAb) are used for treating metastatic colorectal cancer (mCRC). Activating mutations in oncogenes KRAS and NRAS result in resistance to anti-EGFR mAbs, necessitating tumor genotyping prior to the therapy. However, tissue biopsy is an invasive procedure that may fail to address the spatiotemporal clonal heterogeneity of cancer. Circulating cell-free DNA (cfDNA) has been shown to contain oncogenic mutations originating from malignant cells, presenting a promising alternative source of tumor-derived genetic material. We used temperature gradients and dilution series to develop and optimize an enhanced, improved and complete enrichment co-amplification at lower denaturation temperature PCR (E-ice-COLD-PCR) assay for the selective amplification of KRAS codon 12 and 13 mutations in plasma cfDNA; together these mutants comprise approximately 80% of all RAS mutations in colorectal cancer. The amplified variants were detected by subjecting the PCR products to allele quantification by targeted pyrosequencing. 16 mCRC patients were recruited and 4x3 ml of peripheral blood was drawn from each patient into K2EDTA tubes. To evaluate the effect of centrifugation on cfDNA extraction and subsequent mutation testing, plasma was separated according to four different centrifugation protocols: 10 min at 500 x g; 10 min at 500 x g + 10 min at 16,000 x g; 10 min at 1,600 x g; and 10 min at 1,600 x g + 10 min at 16,000 x g. cfDNA was extracted from the plasma using commercially available silica membrane columns and the sample set displaying the least amount of genomic DNA contaminants was tested for KRAS codon 12 and 13 mutations. The results were compared to previously detected mutations in the patients’ tumors. The maximum analytical sensitivity for calling KRAS mutations c.35G>A and c.35G>C was 0.1% and 0.25% mutant in a wild type background, respectively, while the diagnostic limit of detection (LOD) was 0.25%-0.5% (α = 0.05). Concordant with previous studies, the average amount of cfDNA in the patients’ blood was 59 ± 50 ng/ml (x̄ ± sd). Concentrations varied according to the individual centrifugation protocol (P = 0.022). More specifically, plasma centrifuged for 10 min at 500 x g tended to yield slightly less cfDNA than any of the correlated samples, although the pairwise post-hoc comparisons did not reach statistical significance. When the samples were tested for KRAS mutations, the resulting sensitivity was 17% and the specificity 89%. E-ice-COLD-PCR-enhanced targeted pyrosequencing allows for robust and sensitive detection of KRAS c.35G>A and c.35G>C from minute amounts of DNA. Even though the test performance was not directly validated for other hotspot mutations in KRAS codons 12 and 13 (i.e. c.34G>T, c.34G>A, c.34G>C, c.35G>T and c.38G>A), this can be accomplished separately as needed. The method can be used for detecting pathogenic KRAS mutations in the cfDNA of mCRC patients. This may prove useful for tumor genotyping when conventional tissue samples are unavailable or repeated testing is required, e.g. in the early detection of acquired resistance. However, due to the observed sensitivity issues, comprehensive prospective studies are needed to confirm the viability of the test for clinical use.en
dc.format.extent1 verkkoaineisto (50 sivua)
dc.language.isoeng
dc.rightsThis publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.en
dc.rightsJulkaisu on tekijänoikeussäännösten alainen. Teosta voi lukea ja tulostaa henkilökohtaista käyttöä varten. Käyttö kaupallisiin tarkoituksiin on kielletty.fi
dc.subject.othermetastatic colorectal cancer
dc.subject.otherpersonalized medicine
dc.subject.otherKRAS mutation testing
dc.subject.otherE-ice-COLD-PCR
dc.subject.otherpyrosequencing
dc.titlePlasma cell-free DNA in diagnostic KRAS mutation testing
dc.identifier.urnURN:NBN:fi:jyu-201504141582
dc.type.ontasotPro gradufi
dc.type.ontasotMaster's thesisen
dc.contributor.tiedekuntaMatemaattis-luonnontieteellinen tiedekuntafi
dc.contributor.tiedekuntaFaculty of Sciencesen
dc.contributor.laitosBio- ja ympäristötieteiden laitosfi
dc.contributor.laitosDepartment of Biological and Environmental Scienceen
dc.contributor.yliopistoUniversity of Jyväskyläen
dc.contributor.yliopistoJyväskylän yliopistofi
dc.contributor.oppiaineSolu- ja molekyylibiologiafi
dc.contributor.oppiaineCell and molecular biologyen
dc.date.updated2015-04-14T19:28:51Z
dc.rights.accesslevelopenAccessfi
dc.contributor.oppiainekoodi4013
dc.subject.ysosuolistosyövät
dc.subject.ysogeenit
dc.subject.ysohoito
dc.subject.ysomutaatiot


Files in this item

Thumbnail

This item appears in the following Collection(s)

Show simple item record