Effects of perilipin I & V on the phenotype of zebrafish embryos

Abstract

Tämä Pro Gradu-tutkielma on tehty yhteistyössä Tampereen yliopiston Biolääketieteel- lisen teknologian yksikön kanssa. Tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää perilipiinien vaikutusta seeprakalan fenotyyppiin käyttäen tutkimusmenetelminä geenien hiljentämistä ja mikroskopiaa. Geenit säätelevät proteiinien tuotantoa elimistössä. Jokaista proteiinia koodaa geeni, jonka toimintaan puuttumalla voidaan esimerkiksi estää kyseisen proteiinin muodos- tuminen. Morfoliinot ovat oligonukleotideja, joiden avulla voidaan tilapäisesti estää geenien toimintaa. Tässä työssä hiljennettiin morfoliinojen avulla kaksi geeniä seep- rakaloilta: perilipiini 1 ja perilipiini 5. Perilipiinit ovat lipidien varastoitumista sääteleviä proteiineja. Perilipiini 1 edesauttaa lipidien varastoitumista ja perilipiini 5 puolestaan säätelee rasvojen käyttöä energiaksi. Koska tutkittavat proteiinit vaikuttavat elimistön rasvoihin, morfoliinojen vaikutusta tutkittiin lipidivärjäyksellä. Värjäyksessä käytettiin Nile Red- ja LD540-lipidivärejä. Tu- losten perusteella voitiin todeta, että perilipiini 5 eliminointi lisäsi seeprakalojen rasvap- itoisuutta ja muutti selvästi niiden ulkomuotoa. Perilipiini 1 tapauksessa huomattiin, että geenin hiljentäminen tuotti alikehittyneitä, erittäin epämuodostuneita kaloja. Lipidivär- jäyksen tuloksena havaittiin, että rasvan määrä oli näillä kaloilla hieman vähäisempi kuin kontrolleina käytetyillä villityypin kaloilla. Morfoliinokonsentraatiolla todettiin ol- evan vaikutusta lopputulokseen ja kalojen selviytymiseen. Perilipiini 1 tapauksessa par- haat tulokset saatiin 175 ng/nl konsentraatiolla, suuremmat pitoisuudet nostivat al- kioiden kuolleisuutta dramaattisesti. Perilipiini 5 tapauksessa sopivin morfoliinokonsen- traatio oli huomattavasti korkeampi ja parhaat tulokset saatiin 500 ng/nl konsentraati- olla. Alhaisemmilla pitoisuuksilla vaikutukset eivät näkyneet kovin selkeästi.

Lipidien todellisen määrän selvittäminen vaatii lisätutkimuksia, sillä tässä työssä käytetty menetelmä on hyvin epätarkka ja perustuu visuaaliseen arviointiin. Jatko- tutkimuksissa tulee myös käyttää kontrollimorfoliinoa, jotta morfoliinon itsensä aiheut- tamat sivuvaikutukset saadaan eliminoitua.

This study has been done in cooperation with Institute of Biomedical Technology, Uni- versity of Tampere. Aim of the study was to perilipin proteins on the phenotype of zebrafish by using gene silencing and microscopy. Protein production is regulated by genes. For each protein there is a gene coding it and by manipulating the gene for example production of the protein can be prevented. Mor- pholinos are oligonucleotides which can temporarily knock down genes. In this study, two perilipin coding genes were knocked down in zebrafish: perilipin 1 and perilipin 5. Perilipins regulate lipid storage and usage in lipid droplets. Perilipin 1 increases lipid ac- cumulation and storage and perilipin 5 helps body to use lipids as energy. Because perilipins have an effect on the lipids, lipid staining was used to see the effect of Morpholinos. Nile Red and LD540 dyes were used for staining. According to results, knocking down perilipin 5 increases the lipid content in zebrafish and has an effect on the appearance. Knocking down perilipin 1 produced extremely poorly developed indi- viduals. Lipid content of these fish was slightly smaller than that of wild type control fish. The concentration of Morpholinos had significant effect on results and survival rate. With perilipin 1 too high Morpholino concentration produced dramatically poorly developed embryos. The Morpholino concentration of 175 ng/nl produced the best res- ults. With perilipin 5 the concentration of injection solution needed to be higher, the best results were got with the concentration of 500 ng/nl. More studies should be done to determine the real amount of lipids, because in this study lipid content was only estimated visually. In future studies control Morpholinos should also be used to eliminate side effects caused by Morpholino itself.