Characterization of viral nanoparticles and virus-like structures by using fluorescence correlation spectroscopy (FCS)

Abstract

Jouni Toivola tarkasteli väitöskirjatutkimuksessaan geneettisesti manipuloituja viruspartikkeleita. Tutkimuksessa käytettiin fluoresenssikorrelaatiospektroskopiaa. Mittauslaite on harvinainen, sillä Pohjoismaissakin niitä on vain kaksi: toinen Jyväskylän yliopiston Nanoscience Centerissä ja toinen Tukholman Karoliinisessa Instituutissa. Laitteella voidaan analysoida tarkasti makromolekyylien kokoa, lukumäärää sekä niiden välisiä vuorovaikutuksia.Mittauslaite toimii siten, että kun fluoresoiva virus ajautuu liuoksessa laserkenttään, siihen kiinnitetty värimolekyyli virittyy korkeammalle energiatasolle ja luovuttaa fotonin. Fotonien luovuttaminen jatkuu niin kauan, kunnes partikkeli liikkuu vapaalla diffuusiolla pois laserkentästä. Kaikki fotonit mittaustilassa (0.2 femtolitraa) kerätään talteen ja analysoidaan. Isompi molekyyli liikkuu liuoksessa hitaammin kuin pienempi molekyyli, mikä mahdollistaa partikkelin koon määrittämisen. Virukset ovat värimolekyylejä isompia ja sen vuoksi ne viipyvät laserkentässä kauemmin kuin värimolekyylit. Menetelmän korkean erottelukyvyn takia partikkeleiden koon lisäksi partikkeleiden lukumäärä voidaan laskea yksittäisten molekyylien tasolla.Toivolan tutkimus on ensimmäinen, jossa on luonnehdittu sekä vaipallisia että vaipattomia virusten kaltaisia partikkeleita sekä niiden kokoa ja lukumäärää perustuen partikkelien satunnaisdiffuusioon vesiliuoksessa. Tutkimus antoi myös tarkkaa tietoa yksittäisten fuusioproteiinien lukumäärästä viruksen pinnalla. Tutkimuksesta saatuja tietoja voidaan soveltaa esimerkiksi kehitettäessä viruspartikkeleita kohdennettuun syöpäterapiaan.

The movement of viruses can largely be explained by active transport within cellular components, like endosomal vesicles or as diffusion e.g. complexed with antibodies. Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) characterizes single molecules and macromolecular interactions both in solution and in living cells. This analytical method uses a laser excitation source and collects traces of single emission fluctuations from a probe volume of subfemtoliter as fluorescent molecules are driven through the sample by stochastic diffusion. The fluctuation carries information about the size, the concentration, and the chemical reactions of the molecules studied. The baculovirus, Autographa californicamulticapsid nuclear polyhedrovirus (AcMNPV), is an enveloped virus with a physical size of approximately 50 nm X 250 nm and it infects specifically certain lepidopteran species. AcGFPgp64 is a genetically modified version of AcMNPV which has green fluorescent protein (GFP) fused to a major envelope glycoprotein gp64. The results presented in this thesis showed that approximately 4.5 fluorescent units were incorporated in the viral membrane and that the hydrodynamic radius of the virus was 83 ± 19.0 nm. Complexes between human parvovirus B19 virus-like particles (VLPs) and the antibodies present both in acute and past-immunity serum samples gave hydrodynamic radii of 157 ± 151 nm and 69 ± 27 nm, respectively. Cellular localization and diffusion of the recombinant B19 human parvovirus-like particles displaying enhanced green fluorescent protein (EGFP) were described. Finally, the deletions introduced to the amino terminally-truncated canine parvovirus VP2 protein was fused to EGFP. The capability of the truncated VP2 to form capsids was evaluated by monitoring the macromolecular size and the number of the fusion proteins present in fluorescent VLPs. The findings of this thesis gave information about the viral surface composition, viral interactions with antibodies and the diffusion of 1 recombinant enveloped virus and 6 non-enveloped, structurally modified viralnanoparticles.