The importance of ubiquitome in enteroviral infections

Abstract

Enterovirukset ovat yleisiä RNA-viruksia, jotka aiheuttavat monenlaisia sairauksia ihmisille. Huolimatta pyrkimyksistä kehittää tehokkaita ja laajakirjoisia antiviraaleja, tällä hetkellä enterovirusinfektioiden hoitamiseksi ei ole kliinisesti hyväksyttyjä lääkkeitä, ja uusia antiviraalistrategioita tarvitaan. Monet virukset vuorovaikuttavat isäntäsolun ubiquitomi-järjestelmän kanssa. Soluissa tämä järjestelmä osallistuu useisiin perustavanlaatuisiin prosesseihin sekä substraattien proteosomaaliseen hajotukseen. Koska ubiquitomi-järjestelmä voi sekä estää, että edistää virusinfektioita erilaisten entsyymien välityksellä, tämän tutkielman tarkoituksena oli selventää sen merkitystä enteroviruksille. Aiemmin yhdeksän ubiquitomigeenin havaittiin vaikuttavan enteroviruksiin kuuluvan coxsackievirus B3:n (CVB3) infektioon. Havaintojen vahvistamiseksi tässä tutkielmassa kyseiset geenit hiljennettiin pienillä häiritsevillä RNA-molekyyleillä (siRNA), ja transfektoiduissa soluissa etenevää CVB3-infektiota seurattiin immunofluoresenssileimauksella ja konfokaalimikroskopialla, sekä western blot -menetelmällä. CVB3-infektion lisäksi myös coxsackievirus B1:n (CVB1) ja echovirus 30:n (EV30) infektioita tarkasteltiin mahdollisten laaja-alaisten vaikutusten selvittämiseksi. Yhdeksästä geenistä kolmen havaittiin vaikuttavan kaikkiin tutkittuihin viruksiin. Näiden geenien, UCHL1, CHD4 ja FBXL14, hiljentämisellä oli infektioita alentava vaikutus. CVB1- ja EV30-infektiot alenivat myös, kun CAND2-geeni hiljennettiin. Tulosten perusteella valituille siRNA-molekyyleille tehtiin sytotoksisuuskoe, jotta saataisiin lisätietoa merkittäväksi havaittujen ubiquitomitekijöiden potentiaalista antiviraalikehityksessä. Vaikka UCHL1-, CHD4- ja FBXL14-geenien hiljentämisellä oli pieni vaikutus solujen elinkykyyn, mikään siRNA-käsittelyistä ei ollut äärimmäisen toksinen. Havaitut ubiquitomitekijöiden vaikutukset voivat liittyä niiden rooliin enterovirusten elinsyklissä, tai prosesseihin kuten immuunipuolustus ja solusyklin säätely. Vaikka tarkkoja antiviraalimekanismeja ei vielä tunneta, löydös useille enteroviruksille yhteisistä ubiquitomitekijöistä on lupaava.

Enteroviruses are ubiquitous RNA viruses, capable of causing a wide spectrum of diseases in humans. Despite the efforts to develop effective broad-spectrum antivirals, currently there are no clinically approved therapeutics against enteroviral infections, and thus, novel antiviral strategies are needed. Many viruses can interact with the cellular ubiquitome system, which mediates numerous cellular processes and proteasomal degradation of protein substrates. This system can both hinder and promote viral infections, mainly through the activities of ubiquitin ligases and deubiquitinating enzymes. The aim of this thesis was to examine the importance of ubiquitome in enteroviral infections. Previously, nine ubiquitome-related genes were connected to coxsackievirus B3 (CVB3), a type of enterovirus. To validate the previous findings, in this study, the expression of the genes was knocked down with small interfering RNAs (siRNA) and the progression of CVB3 infection was monitored using immunofluorescence labelling and confocal microscopy, as well as western blotting. In addition to CVB3, infections of coxsackievirus B1 (CVB1) and echovirus 30 (EV30) were examined to assess the broad-spectrum effects of silencing ubiquitome-related factors. Knockdown of three genes, namely UCHL1, CHD4 and FBXL14, reduced infections caused by all enteroviruses tested. In addition, the knockdown of CAND2 inhibited CVB1 and EV30 infections. To further inspect the potential of these ubiquitome-related factors in antiviral development, a cytotoxicity assay was conducted for the hit siRNAs. Although UCHL1, FBXL14 and CHD4 knockdown had a slight effect on cell viability, none of the hit siRNA treatments were radically toxic. The anti-enteroviral effects observed in this study may be related to processes such as immune responses or cell cycle regulation. On the other hand, the viruses may also require ubiquitome factors to complete different stages of their life cycle. The exact antiviral mechanisms, however, remain to be determined. In terms of developing broad-spectrum antivirals, the finding that several enteroviral serotypes can utilize same ubiquitome factors is promising.